【正文】 ument Setting窗口。關(guān)閉 Acqusition Control窗口和 Counter計數(shù)框。 4．插上第一管（同型對照管），快速將支撐臂復(fù)位。此前已用樣本細(xì)胞優(yōu)化過條件，獲取和儲存的門及顆粒數(shù)已設(shè)定、文件的儲存已設(shè)定?？删庉?3色或 4色的 Panel。 10．選擇 或 輸入 所有參數(shù)名 選擇：點擊右側(cè)的箭頭，選擇已設(shè)定的參數(shù)名。 2．點擊 Folder，出現(xiàn)對話框，選擇或創(chuàng)建文件夾。只有被選參數(shù)才儲存在 Data file中。 Storage，出現(xiàn) Acquisition amp。 ? 設(shè)定文件儲存參數(shù) ? 創(chuàng)建試劑組合 5． 7． 1 設(shè)置 Acquisition amp。 15．點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause、 Abort。 11．查看 FL4%FL3的補償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補償。 7．若必要，調(diào)節(jié) FL1%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL1/FL2點圖的左上象限。 3．點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。如一個 Panel中有： CD3FITC、CD4FITC、 CD8FITC，則 FITC的補償應(yīng)用 CD8FITC來設(shè)置。若 3色樣本，必要時需調(diào)節(jié) FL2%FL1， FL1%FL2，F(xiàn)L3%FL2， FL2%FL3的補償。 注意：勿調(diào)節(jié) FL4的 PMT電壓，其電壓值有 FACSComp設(shè)定。 11．在其余的圖上，重復(fù) 810步。若無 FL4參數(shù)，請確認(rèn)Detector/Amps 窗口中 Four color 前是否選中。 1．選擇點圖 2．在出現(xiàn)的對話框內(nèi)選擇 X軸： FL1， Y軸： FL2 3．選擇 G1=R1 4．點擊 OK， FL1/FL2的點圖出現(xiàn) 5． 點擊 FL1/FL2點圖的邊框并將之拖至 FSC/SSC圖的右側(cè) 6．同樣建立一個 FL3/FL2的點圖，并選擇 G1=R1。 抗體的這種非特異結(jié)合現(xiàn)象是由于抗體的 Fc端與細(xì)胞膜上的 Fc受體結(jié)合。 5． 6． 6 調(diào)節(jié) FL FL FL3 的探測器（電壓） 在上同型對照管時，可能需基于門內(nèi)的淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié) FL FL FL3的探測器（電壓）。 5． 6． 5 設(shè)置淋巴細(xì)胞 Region BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 12 該 Region在調(diào)節(jié)熒光探測器時使用。 5． 6． 4 調(diào)節(jié) FSC/SSC 探測器（電壓）及 FSC 閾值 在 FSC/SSC點圖上調(diào)節(jié) FSC放大器增益和 SSC電壓是為了將所感興趣的細(xì)胞顯示在圖中。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 10 14. 從 Cytometer菜單中選擇 Threshold。將其拖至空白區(qū)。 OK。出現(xiàn)點圖對話框。 5. 點擊黑矩形右邊的矩形，點擊 OK。 小鼠 IgG1FITC/小 鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/CD4APC。為按上述步驟進行優(yōu)化，需準(zhǔn)備下列樣本： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC。 優(yōu)化： 在此練習(xí)中，您將： ? 建立 CellQuest 實驗文件。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 8 FACSComp運行結(jié)束后，移去標(biāo)準(zhǔn)微球管并插上雙蒸水管。紅色激發(fā)信號 (FL4)需延遲后才能與藍色激發(fā)信號 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)同時到達電子分析部分。 4色：將用 FACSComp進行 PMTs設(shè)置、時間延遲校準(zhǔn)、補償調(diào)節(jié)、敏感度測試。 在進行 3色或 4色獲取時依下列程序進行： 開儀器后開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。 CD3FITC/CD16＋ CD56PE/CD45PerCP/CD19APC。 ? 編輯試劑目錄及組合，以便在獲取時使用。去選擇的圖不受任何命令影響。若需全選，可從 Edit 菜單中選擇select all。點擊圖框即可選擇該圖。點擊除框以外的任何地方即可激活。 鞘液： 顯示鞘液桶是空或 OK。 Standby時儀器的激光器電源降低。 (見圖 4) 狀 態(tài)： 用來在獲取的任何時候查看流式細(xì)胞儀的運行狀態(tài)，以利解決儀器運行中出現(xiàn)的問題。 PE主要出現(xiàn)在 FL2探測器上，但也有 部分重疊到 FL1和 FL3探 測器上。 新版的 CellQuest軟件有雙重閾值設(shè)定。每次只能有一個參數(shù)設(shè)置閾值 (FSC、 SSC、 FL FL FL3)?？赏ㄟ^ 點擊 ??來選擇或直接拖 動滑 標(biāo)上下移動 (見圖 2)?？赏ㄟ^點擊 ?? 來選 擇或直接拖動滑標(biāo)上下移動。 E1: 將信號放大 (101)倍。 (見圖 2) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 4 E00：將信號放大 1(100)倍。 探測器 ： 在流式細(xì)胞儀中有二種探測器：光電二極管和光電倍增管 (PMTs)。調(diào)補償用對照包括單陽性熒光試劑和同型對照試劑，如：調(diào) FITC補償對照包括下列試劑： CD3－ FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠IgG1APC。在 CellQuest軟件中， 儀器的控制菜 單位于 Cytometer 菜單中。一個實驗文件可含上述 3種圖的組合，但獲取圖不能用來分析，分析圖不能用來獲取。 ? 實驗文件可以通用模板儲存以用于常規(guī)獲取和分析。若數(shù)據(jù)文件未改變目錄或被刪除，實驗文件可找到其數(shù)據(jù)文件。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 3 CellQuest實驗文件 ：您設(shè)置的圖、 region、 gate、統(tǒng)計 (statistics)、 markers、文字、顏色 等都將保存。 CellQuest 的文件： FCS list mode數(shù)據(jù)文件 ：是流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)格式數(shù)據(jù)文件（ ）。 13. 直方圖 region：點擊 ，可在直方圖上定位 region 的左邊界和右邊界 14. 橢圓形 region: 點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊，然后拖動對角線至所需大小。 9. 縮?。狐c擊，然后點擊圖，將放大圖縮小到原大小。 5. 密度圖：點擊，可畫密度圖，可自定義圖的大小。 工具板按鈕 (見圖 1) BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 2 1. 等高圖：點擊，可畫等高圖，可自定義圖的大小。 從獲取到分析 在 CellQuest中，從獲取到分析的功能允許在數(shù)據(jù)獲取結(jié)束后可從獲取圖轉(zhuǎn)換到分析圖。在獲取前，需用您的樣本來優(yōu)化儀器的條件。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 1 第五章 CellQuest 軟件 學(xué)習(xí)本章后應(yīng)能夠： ? 用 CellQuest 從流式細(xì)胞儀獲取 3色或 4色樣本 ? 用 CellQuest 從流式細(xì)胞儀分析 3色或 4色樣本 ? 將統(tǒng)計結(jié)果輸出為電子表格 ? 應(yīng)用 Region（區(qū)）和 Gate（門）生成統(tǒng)計 ? 獲取和分析 3色免洗絕對記數(shù)樣本 概述 CellQuest是從流式細(xì)胞儀上進行獲取和分析數(shù)據(jù)的通用軟件。 獲取 即收集并儲存流式細(xì)胞儀上數(shù)據(jù)的過程。在 CellQuest中，可畫單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)點圖、密度圖和等高圖。點擊選擇。 4. 直方圖：點擊，可畫直方圖，可自定義圖的大小。 8. 象限 marker：點擊，可在點圖、密度圖和等高圖上定位 marker 。 12. 多邊形 region：點擊，然后在點圖、密度圖和等高圖中點擊形成起始點，然后拖動鼠標(biāo) 畫出多邊形頂點并在起始點處點擊完成多邊形 region 。 17. 計算器：如果自動復(fù)計算關(guān)閉，點擊進行數(shù)據(jù)復(fù)計算。一個含有 4參數(shù) 10000細(xì)胞數(shù)的數(shù)據(jù)文件若 256道分辨率則文件大小為 45kb，若 1024道分辨率則文件大小為 85kb。 注意：實驗文件和它的數(shù)據(jù)文件之間存在一定限制。 ? 實驗文件可以后打開以恢復(fù)獲取和分析。 ? 在實驗文件中，有 3種圖：獲取、分析和獲 取到分析。需為每一組樣本選擇適當(dāng)?shù)膶φ眨纾号袛喾翘禺愋越Y(jié)合的同型對照。 它將用 于調(diào)節(jié) FSC、 SSC、 FSC閾值、設(shè)淋巴細(xì)胞 region、確認(rèn)FL1/FL2/FL3/FL4的設(shè)置及象限設(shè)置。依據(jù)所選的分辨率的不同，道 值有從 0－ 25 0－ 1023不同范圍?？赏ㄟ^電壓而選擇對 FSC 信號 的不同放 大。 E03: 將信號放大 1000(103)倍。當(dāng)電壓上升時，信號增加，數(shù)據(jù)出現(xiàn)在道值較高處。 若 放大模式選擇 Lin(線性 )，放大器的增益 可在 1－ 。 閾 值 ： 可用來設(shè)置低于該道值的數(shù)據(jù)信號不被處理，只有高于或等于閾值道數(shù)的信號才傳送到計算機進行處理。可通過點擊 ??來選擇或直接拖動 滑標(biāo)上下移動 (見圖 3