【正文】 dflow測(cè)量的例子 [E]0= ?M。配基與酶結(jié)合引起的熒光光 譜變化，有些報(bào)道的例子。 I. 在混合后 12sec觀察， 代表穩(wěn)態(tài)差譜； 7min觀察，反應(yīng)完成。 Fig. 是這種測(cè)量的例子。這種較小的變化適合于 Stoppedflow法的測(cè)量，而不適合于 T jump法的測(cè)量。 第一節(jié) 酶自身光學(xué)性質(zhì)的變化 這些變化可以分成三組： （ 1）必需原子團(tuán)（包括輔基）的吸收或熒光光譜的變化； （ 2）酶蛋白的差吸收光譜； （ 3）酶蛋白質(zhì)的熒光變化。 然而，許多酶（如大多數(shù)水解酶）并不含這種天然探針，就要采用人 工探針或特殊裝置。其中， Stoppedflow 和 Tjump兩種方法在觀察酶反應(yīng)方面已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng) 用。所觀察的變化尤以吸收和熒光變化為最普遍。 對(duì)于可以觀察光吸收或熒光變化的酶反應(yīng)，根據(jù)觀察對(duì)象的不同，可 以把這些酶分成三組： 1. 酶自身（它的必需生色團(tuán)或蛋白部分）； 2. 配基（底物和底物類似物， NAD+ 型輔酶； 3. 指示劑或探針（不參與反應(yīng)，但起到報(bào)告酶分子上發(fā)生變化的 作用）。 下面我們僅討論（ 2）和 （ 3）兩種情況。 但在有些情況，在 300nm附近，觀察 glucoamylase 和底物麥芽糊精 結(jié)合所引起的吸收變化。如果， ΔA/A值較大，也可以進(jìn)行 Tjump測(cè)量。 (b) 同一反應(yīng)的 Stoppedflow時(shí)間曲線。一般來說， ΔF/F要比差吸收光譜的情況 (ΔA/A)大得多。 [S]0=。 NAD+: 10 mM。然而，一般來說， NADH與酶的結(jié)合所引起的變化要比 NAD+與酶的結(jié)合容易觀察。 55?M 醇脫氫酶 + 40 ?M NADH 20 mM NAD+ + M NaCl 混合 透 過 率 變 化 % 50 msec 15% 第三節(jié) 指示劑或探針的使用 如果反應(yīng)不發(fā)生吸收變化或熒光變化，那么為了監(jiān)測(cè)反應(yīng)可以人為 地加入指示劑或探針。 pH指示劑法已廣泛用于快速反應(yīng)的測(cè)量，特別是 TJump法。結(jié)果如 。 根據(jù)理論計(jì)算，選擇 pKa值接近測(cè)量條件下的 pH值的指示劑比較好。 原黃素和猩紅的分子結(jié)構(gòu) 原黃素適合于標(biāo)記 Chymotrypsin 和 Trypsin。有人曾利用原黃素作為探針研究了 Chymotrypsin與抑制劑間相互作用，差光譜圖和 Stoppedflow是間過程 如 。 2. ( ?M)。 [SSI]0 = ?M 2. 共價(jià)結(jié)合探針 探針與酶共價(jià)結(jié)合，可以消除探針與酶間的結(jié)合平衡。由于對(duì) 硝基苯酚基團(tuán)靜電環(huán)境的變化，引起解離狀態(tài)的改變。對(duì)于一個(gè)一級(jí)反應(yīng)來說， 由快速反應(yīng)技術(shù)所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) ， 即反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程曲線 ， 在大多數(shù) 情況下 ， 可以用一個(gè)單指數(shù)曲線或多個(gè)指數(shù)曲線的迭加 （ 稱為符合一級(jí) 反應(yīng) ） 來表示 。 第一節(jié) 弛豫時(shí)間 或表觀一級(jí)速度常數(shù)的計(jì)算 進(jìn)行動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析要做的第一件事是由反應(yīng)曲線計(jì)算表觀的一級(jí) 速度常數(shù) 。 對(duì) χ = A + B et/? （ ） 其中 ?是弛豫時(shí)間 ， 1/?是一級(jí)速度常數(shù) kapp， A和 B是常數(shù) 。 然而 ， 問題并非如此簡單 。 如果用計(jì)算機(jī)的話 ， 可以利用試探誤差 法 （ trialanderror） ， 通過改變 χ ∞ 值 ， 一直到 Ln ?χ χ ∞ ? ? t圖有 最好的線性擬合 。 這一程序可以用圖 。 當(dāng)兩個(gè)弛豫時(shí)間彼此可以分開的話 ， 則可以分別計(jì)算 ?1和 ?2。 那么 ， χ 和 χ 1之間的差為 χ χ 1= A1et/?1 （ ） 圖 。由直線 B′ 的斜率 和在縱軸上的截矩可以分別得到 1/?2和 A2。 若 A1和 A2差越大 ， 而 ?1和 ?2差 越小 ， 分離兩組分就越困難 。 這一性質(zhì)可用于探測(cè) 表觀單弛豫曲線是否包含多個(gè)弛豫過程 。 1. 一步弛豫機(jī)制 一個(gè)可逆的雙分子結(jié)合過程可以用下式表示 ， 讓 表示在 Tjump之前溫度為 T′時(shí) ， 第 i 種物質(zhì) （ A,B,C） 平衡時(shí)的濃度 ,， 為 Tjump之后 ， 在新的溫度 T 時(shí) ， 第 i種物質(zhì)的平衡濃度 。 A + B Ck + 1k 1CiCi ′Ci ′ CiCi ′ CiCiΔCi(t) 從 Fig, ， 為總濃度的變化。簡化后，該式變成 d ?C/dt = [k+1( ) + k1] ?C ≡ ?C/τ () 1/ τ= k+1 ( ) + k1 () 實(shí)際上， △ C的一級(jí)速度方程。 由直線的斜率和 截矩 ， 可以得到向前和向后反應(yīng)的速度常數(shù) （ k+1和 k1） 。 那么，為了準(zhǔn)確測(cè)定平衡濃度 和 ，要完成下面計(jì)算： 令 K1為 C解離成 A和 B的解離常數(shù) K1 = k1/ k+1 = / () 因?yàn)? ， () 那么， ， () 而， () 由 ， = () 把由 代入 ，則 可以用 和 及解離常數(shù) K1表示： = K1 () CA CB Ci0CA0 CB0CA CB CACB CC C A 0 = C A + C C C B 0 = C B + C CC A = C 0A C C C B = C 0B C CC A + C B = ( C 0 A + C 0 B ) 2 C CC C = C A C B / K 1( C 0 A C C ) ( C 0 B C C ) / K 1CC CA+CB C0A C0BC A + C B = ( C 0 A + C 0 B ) 2 C C( C 0 A + C 0 B + K 1 ) 2 4 C 0 A C 0 B如此，把 和 及 K1表示的 1/ τ 的方程。這可由下面的迭代法計(jì)算。使這個(gè)過程繼續(xù)下去，直到獲得 1/τ對(duì) 的線性關(guān)系的最佳擬合值（最小二乘法）。 再利用 K = k+1 / k1 可以分別求出 k+1和 k1 。 與處理一步反應(yīng)機(jī)制一樣，在 Tjump之后，把每一組分的平衡濃度表 示為 ，時(shí)間 t 時(shí)的濃度為 Ci , 濃度變化用 ΔCi 表示，定義如下， ΔCi = Ci () A + B Ck + 1k1A + B Ck + 1k 1k + 2k 2 DC DCiA Bk + 1k 1Ci 在 Tjump前后， Ci的總濃度為 Δ ，定義如下， () A和 B的起始濃度分別為 和 ， 那么， () () 四種濃度 Ci (i =A,B,C,D)中 ， 有三種濃度 CA， CB和 CD是獨(dú)立變量 。 如果用 x1和 x2分別代表 ΔCA和 ΔCD，那么上兩個(gè)微分方程有如下形 式 dx1/dt = a11x1 + a12x2 dx2/dt = a21x1 + a22x2 （ ） 這里 aij 為常數(shù)。 [ Σk + (Σk )2 4 Πk ] （ ） 式中， Σk ≡ k+1 ( CA + CB ) + k1 + k+2 + k2 4Π≡ k+1 (k+2 + k2) (CA + CB ) + k1 k+2 （ ） 由 到 ， 我們有下面兩個(gè)弛預(yù)時(shí)間倒數(shù)和與積的關(guān)系， L ≡1/ τ1 + 1/ τ2 = Σk = k+1 ( CA + CB ) + k1 + k+2 + k2 （ ） M ≡ (1/ τ1)( 1/ τ2 ) = Πk = k+1 (k+2 + k2) (CA + CB ) + k1 k+2 （ ） 因此，可以得到關(guān)于 L和 M對(duì) ( CA + CB ) 的線性圖，也可以求出所有的 速度常數(shù)，當(dāng)然前提是兩個(gè)弛預(yù)時(shí)間能分得開。 (a) 當(dāng)雙分子過程比單分子過程快得多時(shí)， 即 k+1 ( CA + CB ) + k1 + k+2 k+2 + k2 那么， 由 和 式，馳預(yù)時(shí)間的表示可以簡化 （ ） （ ） 其中， K1 為 C解離成 A+B的解離常數(shù)。 (b) 當(dāng) 比 慢得多或 k+1 ( CA + CB ) + k1 k+2 + k2 時(shí) ，