【正文】 用配基光學(xué)性質(zhì)的變化可以監(jiān)測酶反應(yīng)，其中包括底物化學(xué)變化 （廣義上也包括輔酶），酶與配基非共價(jià)結(jié)合而引起的配基光學(xué)性質(zhì)的 變化。 是葡萄糖淀粉酶和麥芽寡糖引起的酶熒光的變化的例 子。 二 . 酶蛋白質(zhì)熒光變化 在 280nm激發(fā)，對大多數(shù)酶，可以得到中心在 300380nm的熒光光 譜，主要是由 Trp和（或） Tyr殘基產(chǎn)生的。 [S]0=。在 300 nm附近的變化，只少可以部分地歸于 trp靜電環(huán)境的變化。一般來 說， 這種變化很小， ΔA/A（ A為背景，即蛋白質(zhì)本身的吸收）范圍在 %。本章通過討論一些實(shí)例，介紹檢測酶反應(yīng)的技術(shù)。我們可以把這些生色團(tuán)視為觀察酶反應(yīng) 的天然探針。第三章 酶反應(yīng)的觀察 Observation of enzyme reactions 在第二章，我們已經(jīng)討論了各種測量溶液中快速反應(yīng)的技術(shù)。對那些含生色團(tuán)，像 血紅素 (Heme), 核黃素 (Flavin), 磷酸吡哆醛（ Pyridoxal phosphate)等的 酶特別適合于這些技術(shù)的應(yīng)用。 由于檢測技術(shù)的發(fā)展，快速反應(yīng)技術(shù)在研究各類酶反應(yīng)已獲得廣泛 應(yīng)用。 一 . 酶蛋白質(zhì)的差吸收光譜 當(dāng)配基與酶結(jié)合的瞬間或隨后的過程，在 260nm310nm范圍，可以 觀察到由于酶蛋白 Trp或 Tyr微環(huán)境的變化所引起的差吸收光譜。在這一波長，背景吸收較小， ΔA/A較大。 葡萄糖淀粉酶結(jié)合底物的特征差吸收譜和 Stoppedflow 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) (a) 差光譜， , 25 ℃ ， [E]0 = 22 ?M。 303 nm, pH , 5 ℃ ， 10 mm Cell, [E]0= ?M, [S]0=。因而 Stoppedflow和 Tjump法都適合于測量酶熒光的這 種變化。 pH , 5 ℃ 。 豬心乳酸脫氫酶 :2mg/ml 二 . 配基與酶非共價(jià)結(jié)合引起的配基光學(xué)性質(zhì)的變化 某些核苷酸，如 NAD+或 NADH與酶結(jié)合時(shí)常常發(fā)生吸收或熒光光 譜的變化。用 NAD+取代酶結(jié)合的 NADH的 Stopped Flow 時(shí)間曲線見 , 其中， NAD+是大過量的。 一 . pH 指示劑 伴有可解離基團(tuán) pK值改變的反應(yīng)，通常涉及質(zhì)子的結(jié)合或釋放。 pH指示劑本身 H+ 轉(zhuǎn)移非常快，通常不到 ?Sec, 因此弛預(yù)時(shí)間大于 10 ?Sec的反應(yīng)，可用該法測量， 且安全可靠。 使用 pH指示劑進(jìn)行 Tjump 測量 的例子。 二 . 酶結(jié)合的探針 把特殊的染料以共價(jià)或非共價(jià)形式連接到酶分子上，起到報(bào)告在反應(yīng) 過程中酶分子發(fā)生變化的作用。 而猩紅適合于標(biāo)記 Lysozyme 和 Chymotrypsin。 ?Chymotrypsin 與 SSI (鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑） (a) 差光譜（ EdyeSSI) 10msec 每格 每格 [E]0= ?M 。 3. ( ?M)。在蛋白質(zhì)中， 氨基酸的反應(yīng)基團(tuán)如 SH, ?NH2(Lys)很適合于化學(xué)修飾。這種 變化反映在 400nm附近光譜的變化上。 由這些曲線可以計(jì)算反應(yīng)的弛豫時(shí)間 （ τ ） 或表觀的一 級速度常數(shù) （ kapp） 。 停流法和溫度跳躍法比較容易進(jìn)行重復(fù)測量 ， 因而可以獲 得速度常數(shù)的平均值 。 χ 0和 χ ∞ 分別代表 χ 的初值和終值 。 如果能準(zhǔn)確測量 χ ∞ ， 當(dāng)然 ， 這種方法很簡單 。 對于不知道 χ ∞ 的情況 ， 可以采用 Guggenheim作圖法求 kapp。 (a) 反應(yīng)曲線 t1/2= xt=為時(shí)間 t時(shí)的測量 (b) 由曲線 (a)得到的 Guggenheim圖 Δt=5msec=(), 一級速度常數(shù)由直線斜率乘以 。 在較快的過程實(shí)際已結(jié)束后 ， 即 t ?1， 了 ,則有 χ =A0 + A2et/?2 （ ） 式中 ?2和常數(shù) A0， A2可以根據(jù)單指數(shù)法計(jì)算 。 (a) 反應(yīng)曲線 , 用 x= A0+A1et/?1+A2et/?2表示 ?1=1ms, ?2=5ms, x為任意單位 。利用這 些值可以繪出（ a）中的 B′ ； (c) 表示 (a) 中 A 和 B′ 間的差，相應(yīng)于第二項(xiàng) A1et/?1。 當(dāng) ?1/?23， A1/A20， 那么 ， 時(shí)間過程可以 用一個(gè)單指數(shù)曲線來近似 ， 并且由這個(gè)曲線可以得到表觀弛豫時(shí)間 ?a。 另外 ， ?1/?2值可隨實(shí)驗(yàn)條件 （ pH， 溫度等 ） 變化 ， 因而可以通過改變反應(yīng)條件來分開兩個(gè)弛豫組 分 。 在馳預(yù)期間 ， Tjump之后 ， 第 i 種物質(zhì)的濃度由 (t=0)變化到 如 Fig, 。在時(shí)間 t時(shí)，第 i 鐘物質(zhì) 濃度變化為 ?Ci, 被看成是對終濃度 的偏離。這意味著由于微擾很 小，結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間過程可以很好地近似為一個(gè)一級過程。 乍看起來 ， 繪這個(gè) CA+CB CA+CB CA+CB CC CA+CB C C CA+CB CiCiΔ圖很容易，其實(shí)不然。 如上所見，為了計(jì)算平衡濃度必須先知道 K1。 首先假定一個(gè)近似的 K1(=k1/k+1), 它可以從 1/τ對 圖來估計(jì) （非嚴(yán)格線性）。 有一種更簡便的近似方法，在許多情況下可以利用。 2. 兩步弛豫機(jī)制 (近平衡處理） 根據(jù)化學(xué)弛豫理論 ， 可以證明含有 n個(gè)獨(dú)立階段的可逆反應(yīng)最多可以 出現(xiàn) n 個(gè)弛豫過程 ， 并且至少在原則上可以求出每步弛豫時(shí)間 ?。 因此 ， △ CA， △ CB和 △ CD為獨(dú)立變量 。 Δ C i C ik + 1 C A C B = k 1 C Ck + 2 C C = k 2 C D d Δ C A / d t = [ k + 1 ( C A + C B ) + k 1 ] Δ C A + k 1 Δ C D d Δ C D / d t = k + 2 Δ C A + ( k + 2 + k 2 ) Δ C D x1 = A11 e – t /τ1 + A12 e –t /τ2 x2 = A21 e – t /τ1 + A22 e –t /τ2 （ ） 這里 Aij 為常數(shù)，相應(yīng)于弛預(yù)信號振幅，兩個(gè)弛預(yù)時(shí)間為 τ1 和 τ2 。 從 到 ，兩個(gè)弛預(yù)時(shí)間包含兩個(gè)反應(yīng)步驟的 速度常數(shù)，而它們對每一個(gè)單獨(dú)步驟的貢獻(xiàn)無法被分開。 K1 = k1/k+1 由上面可以看到 ， 即較快的弛豫時(shí)間 ?1簡單地與較 快的單獨(dú)的雙分子過程的弛豫時(shí)間相關(guān) ， 而與慢過程 C === D無關(guān) 。 圖 。 1 /τ 2 = k + 1 ( C A + C B ) + k 1 k 2k + 2 + k 2 兩步反應(yīng) 1/ τ的濃度關(guān)系 I 和 II分別相應(yīng)于較快和較慢的馳預(yù)， 馳預(yù)時(shí)間為 τ1和 τ2。 3. 一般的多步機(jī)制 對包括 n個(gè)獨(dú)立步驟的可逆反應(yīng)，如下式所示， （ ） 由上述機(jī)制可以得到下面的微分方程組 dΔCi / dt = (j = 1,2,2,… .n) 式中 ΔCi 表示第 i 種物質(zhì)濃度變化（相對于平衡濃度）， aij 是常數(shù)，它 包括速度常數(shù)和平衡濃度。因此，對 n步機(jī)制來說，它最多有 n個(gè)弛預(yù)時(shí)間。 二 . 停流法數(shù)據(jù)分析（遠(yuǎn)平衡處理） 如果把 “ 弛豫 ” 這一術(shù)語理解為一個(gè)化學(xué)體系對一種微擾的應(yīng)答 ， 那么 ， 我們可以把 化學(xué)弛豫法定義 為：通過某種適當(dāng)?shù)姆椒ò岩粋€(gè)微 擾施于體系而來測定速度常數(shù)的方法 。 1. 可逆反應(yīng) 在停流實(shí)驗(yàn)中 ， 由于反應(yīng)物混合后產(chǎn)物的濃度變化很大 ， 因而 ， 不等式 ??Ci? Ci 不再成立 。 （ ）式形式復(fù)雜， 但在特殊情況下，可以簡化形式。 k+1′ = k+1CA0 二級速度常數(shù) k+1， 可由 k+1‘ 對 CA0作圖得到 ， 若精確度不高的話 ， 可以用 CA0除 k+1′ 得到 。下面我們僅討論預(yù)穩(wěn)態(tài)和非穩(wěn)態(tài)（ b) 。 假定 s ≈ s 0 dx/dt = k+1 e0s0 ( k+1s0 + k1 + k+2)x () 積分后，得 () 其中， λ 定義為 λ = k+1s0 + k1 + k+2 使用米氏常數(shù) Km=( k1 + k+2)/k+1 X 可以表示為 () 當(dāng) [ES]= 時(shí)，表明 [ES}達(dá)到穩(wěn)態(tài)濃度， λ 為一級速度常樹， 見 x = k + 1 e 0 s 00λ ( 1 e λ t )x = e 0 s 0 0 ( 1 e λ t ) Km + s 0[ E S ] =e 0 s 0 0Km + s 0 兩段機(jī)制初相的時(shí)間過程 (a) 根據(jù) （ ES的生成）； (b)根據(jù) （ P的生成）。 通過研究 τ l 和 ?0 對底物濃度 s0 的 關(guān)系，可以得到 () 式中的全部速度常數(shù) k+1， k1 和 k+2 。他使用對 硝基苯酚作為 pH指示劑，跟蹤無花果蛋白酶催化的苯甲酰 L精氨酸乙酯 (BAEE)的水解。 顯示出遲滯相和預(yù)穩(wěn)態(tài)的例子。(b)10mM。 將 ()式代入 ()式， 消除 x, 得到只含 p的微分方程 p″+ (k+1/ k +2) (p′)2 + [k+1 (e0 + s0)+ k1 + k +2] p′ k+1p p′+ k+1k +2 e0 p k+1k +2 e0 s0 = 0 () 這個(gè)方程的解給出 p, x 和 s的時(shí)間過程。 兩步機(jī)制的數(shù)字計(jì)算機(jī)解 計(jì)算中使用了 e0 = 1 μM。 然而， Chance曾提出一個(gè)簡單的程序，在有些情況下是可以用的。 首先， 計(jì)算 ES曲線下的面積。 面積 A可以通過作圖積分得到， 也可以用一個(gè)假定的三角形近似地 求出。 已經(jīng)用 Chance 法研究了過氧化氫酶 (Catalase)和過氧化物酶 （ Peroxidase)反應(yīng)。用下式表示這個(gè)反應(yīng)： ()