【正文】 a22 = k+2 + k2 a 1 1 λ a 1 2a 2 1 a 2 2 λ = 0CA+ CD把 式代入 式， λ1 = 1/ τ1 = 189。 然而 ， 慢過程受快過程的影響 ， 因此 ?2含有較快過程的速度常數(shù) 。 A + B Ck + 1k 1 k + 2k 2 D (a) 比 快得多（見 ） ，這里 K1 等于當 1/τ2 = （ k+2+2k2)/2 時（ CA + CB)濃度。然而，實際上，大小接近的 τ很難分開，某些信號振幅小，也不容易探測到。 對于下述反應 （ ） 可以得到有關 ?C 的微分方程 d ?C /dt = ｛ k+1 [( CA + CB ) ?C ] + k1｝ ?C = [ k+1 [( CA + CB )+ k1 ] ?C k+1 (?C)2 （ ） A + B Ck + 1k 1此時， (?C)2 不能再略去，然而，微分方程 仍有解析解，但形式 復雜一些。 (2) 當 CA0 = C B0時，則有 d CA/dt = k+1CA2，積分后， 1/CA=1/ CA0 + k+1t （ ） 讓 CA=CB≡ C, CA0 = C B0≡ C0， 那么 1/C = 1/C0 + k+1t （ ) 由 1/C對 t圖的斜率可得到 k+1。 把方程 ， 積分后得到產(chǎn)物的時間過程 P = [P] = ?0t Pl( 1 eλ t) () 式中 ?0為穩(wěn)態(tài)初速度， () Pl 可以表示為 () 正如從 ， P的時間過程為一條直線，斜率為 ?0，直線開頭有一個 Lag。從 ，反應曲線有一個 Lag。 (c) 50mM. τ l 的長度隨底物濃度的不同而不同。 S0 = 8 μM。 為此寫出速度方程： dp/dt = k+2 x () 積分， p = k+2∫0t x dx + 常數(shù) () 如果積分是從 t=0 到 t = ∞ ， 那么， k+2∫0t x dx = p ∞ = s0 = k+2A () 其中， A為 [ES]=x曲線下的面積。通過直接觀察 ES復合物形成過程，可以更一般地 直接計算 k+1和 k+2。 在 x = xmax /2 時的 s0值，用 s1/2表示 () k + 2 = s 0xm a x t1 / 2x m a x = se 0k 1 + k + 2k + 1 + sk + 1 = k 1 + k + 2s0 ( e 0 / x m a x 1 )如果 k+2 k1 ， 那么， 利用 () 式， 則 () 式為 () 如此，我們可以利用 Chance法， 由 中曲線計算 k+1?，F(xiàn)以 tryptophan pyrrolase(吡咯酶 )為例，加以說明。結(jié)果如 所示。 底物濃度為 (a)4mM。 Gutfreund 最先分析了蛋白水解酶反應預穩(wěn)態(tài)的過程。為簡化起見，只考慮初相，即只有少量底物被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。根據(jù)條件的不同，有下面的一些結(jié)果： (1) 在 CA0? C B0時，則有 A + B k + 1 Cl n [ ]C A0 ( C B 0 C C )C B 0 ( C A 0 C C ) = ( C B0 C A 0 ) k + 1 t（ ） 若 CA0CB0, 則可以把反應看成是一級反應 ， 表觀一級速度常數(shù)為 k+1′ 。 從這個意義上來說 ， 可以把 停流法的數(shù)據(jù)分析稱為遠平衡處理 。它包括平衡濃度和速度常數(shù)，也依賴于 弛預時間。如果能測出兩個 弛豫時間，那么，所有的速度常數(shù)也可以求出來。 (a) 當雙分子過程比單分子過程快得多時， 即 k+1 ( CA + CB ) + k1 + k+2 k+2 + k2 那么， 由 和 式，馳預時間的表示可以簡化 （ ） （ ） 其中， K1 為 C解離成 A+B的解離常數(shù)。 如果用 x1和 x2分別代表 ΔCA和 ΔCD，那么上兩個微分方程有如下形 式 dx1/dt = a11x1 + a12x2 dx2/dt = a21x1 + a22x2 （ ） 這里 aij 為常數(shù)。 再利用 K = k+1 / k1 可以分別求出 k+1和 k1 。這可由下面的迭代法計算。 由直線的斜率和 截矩 ， 可以得到向前和向后反應的速度常數(shù) （ k+1和 k1） 。 A + B Ck + 1k 1CiCi ′Ci ′ CiCi ′ CiCiΔCi(t) 從 Fig, ， 為總濃度的變化。 這一性質(zhì)可用于探測 表觀單弛豫曲線是否包含多個弛豫過程 。由直線 B′ 的斜率 和在縱軸上的截矩可以分別得到 1/?2和 A2。 當兩個弛豫時間彼此可以分開的話 ， 則可以分別計算 ?1和 ?2。 如果用計算機的話 ， 可以利用試探誤差 法 （ trialanderror） ， 通過改變 χ ∞ 值 ， 一直到 Ln ?χ χ ∞ ? ? t圖有 最好的線性擬合 。 對 χ = A + B et/? （ ） 其中 ?是弛豫時間 ， 1/?是一級速度常數(shù) kapp， A和 B是常數(shù) 。對于一個一級反應來說， 由快速反應技術所得到的實驗數(shù)據(jù) ， 即反應的時間進程曲線 ， 在大多數(shù) 情況下 ， 可以用一個單指數(shù)曲線或多個指數(shù)曲線的迭加 （ 稱為符合一級 反應 ） 來表示 。 [SSI]0 = ?M 2. 共價結(jié)合探針 探針與酶共價結(jié)合，可以消除探針與酶間的結(jié)合平衡。有人曾利用原黃素作為探針研究了 Chymotrypsin與抑制劑間相互作用，差光譜圖和 Stoppedflow是間過程 如 。 根據(jù)理論計算，選擇 pKa值接近測量條件下的 pH值的指示劑比較好。 pH指示劑法已廣泛用于快速反應的測量，特別是 TJump法。然而，一般來說， NADH與酶的結(jié)合所引起的變化要比 NAD+與酶的結(jié)合容易觀察。 [S]0=。 (b) 同一反應的 Stoppedflow時間曲線。 但在有些情況，在 300nm附近，觀察 glucoamylase 和底物麥芽糊精 結(jié)合所引起的吸收變化。 對于可以觀察光吸收或熒光變化的酶反應，根據(jù)觀察對象的不同，可 以把這些酶分成三組： 1. 酶自身（它的必需生色團或蛋白部分）； 2. 配基（底物和底物類似物， NAD+ 型輔酶； 3. 指示劑或探針（不參與反應，但起到報告酶分子上發(fā)生變化的 作用）。其中， Stoppedflow 和 Tjump兩種方法在觀察酶反應方面已經(jīng)獲得了廣泛的應 用。 第一節(jié) 酶自身光學性質(zhì)的變化 這些變化可以分成三組： （ 1）必需原子團（包括輔基）的吸收或熒光光譜的變化； （ 2）酶蛋白的差吸收光譜； （ 3）酶蛋白質(zhì)的熒光變化。 Fig. 是這種測量的例子。配基與酶結(jié)合引起的熒光光 譜變化，有些報道的例子。 一 .配基化學變化 在有脫氫酶催化的反應中 ,輔酶 NAD(P)+(CoII)發(fā)生如下變化 , 同時 伴隨吸收和熒光變化 . 乳酸脫氫酶催化下述反應 , N A D ( P ) + N A D ( P ) HL 乳 酸 + N A D + ( C o I ) 丙 酮 酸 + N A D H由 Tjump法得到的該反應的弛預過程如 . NAD+ NADH相互轉(zhuǎn)化時在 340nm的變化 Tjump弛預曲線 , ΔT: 0 ℃ ℃ Llactate: 2mM。 觀察波長： 340nm。苯硼酸代表絲氨 酸蛋白酶一種可能的過度態(tài)類似物。在吸收譜上可以看到所伴隨的變化。 [SSI]0= 0 (0 ?M ), 1. ( ?M )。 例如， Burr和 Koshland 把作為報告基團的染料 2溴乙酰氨基 4硝基苯酚 （ 2bromoacetamido4nitrophenol) 共價結(jié)合到 Chymotrypsin 的蛋氨酰殘 基上。 為解釋反應 機制 ， 需要由表觀的一級速度常數(shù)計算各個反應階段的速度常數(shù) ， 即微 觀速度常數(shù) 。 這是計算 kapp的 標準程 序 。 △ t 的 選擇對 k值有影響 ， 最好選擇 12倍的 t1/2值作為 △ t。 用 χ 1表示這一曲線 。 個弛豫時間的反應曲線的 分析 x 3 2 4 1 4 0 2 2 Ln(xx∞） 在雙指數(shù)反應曲線中快慢兩個組分的分離條件取決于兩個組分振幅 （ A1和 A2） 和弛豫時間 （ ?1和 ?2） 相對大小 。 因此 ， 這種方法稱為近平衡處 理 。 因為 d CA/ dt = d( ?C)/dt = d ?C/dt = k+1 CA CB k1 CC 所以， d ?C/dt = k+1( ?C)( ?C) k1( +?C) = (k+1 k1 ) – [k+1( + )+ k1 ] ?C + k+1(?C)2