【正文】 以RNA為模板合成cDNA鏈 單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）；雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）；雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）【特異性地從5‘ 端外切】；單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶【降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍，比降解單鏈RNA快7倍】5．核酸修飾酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）；堿性磷酸單酯酶【小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）amp。大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow 酶）：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。 末端）在 30 分鐘內(nèi)連接 50% 所需的酶量為 1 個 NEB 單位。羅馬數(shù)字表示同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶。引起星活性的因素： ① 高濃度甘油（5%）、② 酶過量（100U/mg）、③ 低離子強度（25mM）④ 高pH ()、⑤ 有機溶劑、⑥ 用其它二價陽離子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+, Zn2+。、僅有限制性內(nèi)切酶活性，無甲基化酶活性。 第二章 DNA重組克隆的單元操作一、用于核酸操作的工具酶1. 限制性核酸內(nèi)切酶(主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵)。 （2）重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標記（抗菌素抗性）的載體分子上。：遺傳工程→DNA重組技術(shù)→分子/基因克?。∕olecular/Gene→基因工程→基因操作。應(yīng)用領(lǐng)域以“基因工程”、“DNA重組”為主基因工程基因工程的歷史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1978：Genetech公司在大腸桿菌中表達出胰島素1982：世界上第一個基因工程藥物重組人胰島素上市1988：PCR技術(shù)誕生1989：我國第一個基因工程藥物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一個基因治療藥物重組腺病毒p53上市基因（供體）：外源基因、目的基因載體：能將外源基因帶入受體細胞，并能穩(wěn)定遺傳的DNA分子（克隆載體、表達載體）。 （3）重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞中。限制性核酸內(nèi)切酶的功能與類型主要特征I型II型III型功能限切/修飾限切限切/修飾蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體單體異源二聚體輔助因子ATP Mg2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM識別序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋轉(zhuǎn)對稱序列GAGCCCAGCAG切割位點距識別序列1kb處識別序列內(nèi)距識別序列下游2426bp處其中II型限制性核酸內(nèi)切酶：切割位點專一，適于DNA重組，是DNA重組中最常用工具酶。：5’突出末端、3’突出末端、：大多為37℃,適鹽濃度：高鹽、中鹽、低鹽。 II型限制性核酸內(nèi)切酶的命名具體規(guī)則是：以生物體屬名的第一個大寫字母和種名的前兩個小寫字母構(gòu)成酶的基本名稱，如果酶存在于一種特殊的菌株中，則將株名的一個字母加在基本名稱之后，若酶的編碼基因位于噬菌體（病毒）或質(zhì)粒上，則還需用一個大寫字母表示這些非染色體的遺傳因子。特殊性質(zhì)的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又稱異源同序酶或異源同工酶，是指識別位點與切割位點均相同的不同來源的酶識別相同序列，如HindIII – HsuI: A / AGCTT同尾酶：是指識別位點不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一類酶，如BglII：A / GATCT；BamHI: G / GATCC。①大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）基本性質(zhì)：1. 5‘→3‘的DNA聚合酶活性 2. 5‘→3‘的核酸外切酶活性 3. 3‘→5‘的核酸外切酶活性大腸桿菌DNA聚合酶 I 的基本用途： translation 。Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP）】；T4多核苷酸磷酸激酶（T4PNP）二、用于克隆的載體1. 載體（Vector）：是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細胞，使之傳代、擴增或表達的工具。②整合型載體：不含復(fù)制子，需借助同源重組機制整合于宿主基因組。還有pUC18/19；T載體，詳見ppt，了解一下。結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：由轉(zhuǎn)位作用和重組作用所引起的質(zhì)粒DNΑ的重排與缺失。λDNA兩端各帶有一個12bp的粘性末端，稱為cos位點。2. Lac Z基因插入失活：在lac Z基因上有EcoR I位點，插入失活后利用Xgal法篩選（藍白篩選）。第二，將上述所得的λ DNA臂同外源DNA片段連接。cos質(zhì)粒：lamda DNA的cos區(qū)和質(zhì)粒組成的載體: 3145 kb（3）考斯質(zhì)粒載體的特點：， 3. 重組操作簡便，篩選容易 4. 裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍 5. 不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞.（4）人工染色體載體人工染色體實際上是一種“穿梭”克隆載體：含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體（大腸桿菌）源質(zhì)粒復(fù)制起始位點（ori），還含有第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點、端粒和復(fù)制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因。適用于外源DNA的擴增和克隆、基因文庫的構(gòu)建和外源基因的高效表達，是DNA重組實驗和基因工程的主要受體菌。適用于重組蛋白與多肽、特別是微生物來源的酶的高效分泌表達。D. 酵母菌——具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定。DNA重組操作系統(tǒng)欠完善。適用于哺乳類動物和人的基因表達調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實驗和基因工程的主要哺乳動物受體。實驗室常用的基因工程受體（宿主）：大腸桿菌；真菌：酵母菌（畢赤酵母，漢森酵母，啤酒酵母）amp。②電轉(zhuǎn)化法 ③熱激法轉(zhuǎn)化率的定義：每微克DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌能獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)。 不同轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化率：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化——106 – 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化——105 – 106 / mg DNA λDNA轉(zhuǎn)染——107 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化——106 – 109 / mg DNA 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含有全部基因）amp。轉(zhuǎn)化受體細胞——如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞。④化學(xué)合成法（全基因合成）基因文庫的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕剩琭 = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小。：可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術(shù)等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟。（沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄）。常用原核基因啟動子：【lac (乳糖啟動子)；trp (色氨酸啟動子)；tac（乳糖和色氨酸的雜合啟動子——Ptac = Ptrp 的35區(qū)+ Plac的10區(qū)）；T7啟動子】——IPTG誘導(dǎo)；PL和PR(λ噬菌體的左向和右向啟動子)——溫控（熱誘導(dǎo)），30℃/37℃培養(yǎng)， 42℃誘導(dǎo)。噬菌體DNA上的TФ B、二聚體終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)C、核糖體結(jié)合位點（RBS） mRNA 5’端非翻譯序列,包括SD、起始密碼子、SD與起始密碼子間的序列、起始密碼子下游序列。 同步表達相關(guān)tRNA編碼基因三、大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達包涵體：胞內(nèi)高效表達時，工程菌因大量合成異源蛋白質(zhì)所形成的水不溶性積聚物。表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)形式：a)部分屬于折疊過程中的產(chǎn)物；b)部分為無序卷曲與聚集，分子內(nèi)二硫鍵錯配。包涵體的溶解與變性 包涵體的溶解與變性的主要任務(wù)是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復(fù)性途徑中。包涵體的復(fù)性與重折疊的主要挑戰(zhàn)是： 聚集沉淀融合型異源蛋白的表達以融合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點①目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對分子量較小的多肽效果更佳 ②目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白 ③目的蛋白表達率高 與受體蛋白共用一套完善的表達元件 ④目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性 ⑤缺點：融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。以分泌形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點A、分泌表達形式的優(yōu)點：①目的蛋白以呈正確折疊的可溶形式存在（周質(zhì)為氧化型環(huán)境，利于二硫鍵形成）②目的蛋白穩(wěn)定性高（周質(zhì)腔蛋白酶少）③目的蛋白末端完整 相當多的真核生物成熟蛋白N端并不含有的甲硫氨酸殘基便可在信號肽的剪切過程中被有效除去 B分泌表達形式的缺點：相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制并不健全。②目的蛋白高效表達——在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù) ③目的產(chǎn)物回收困難四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化(1)工程菌構(gòu)建與分析(2)工程菌遺傳穩(wěn)定性分析 在非選擇條件下連續(xù)傳代數(shù)代后，對工程菌重組質(zhì)粒存在狀況、結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性進行一下三項分析： A、存在狀況：宏觀逃逸率 B、結(jié)構(gòu)完整性：酶切圖譜分析、序列分析 C、功能完整性：表達水平工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式分配不穩(wěn)定性（主要）：整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失重組質(zhì)粒的逃逸：工程菌部分細胞因質(zhì)粒丟失而不再攜帶重組質(zhì)粒的現(xiàn)象?！?宏觀逃逸率（%）=（非選擇性平板菌落數(shù)—選擇性平板菌落數(shù)）/非選擇性平板菌落數(shù)100(3)發(fā)酵工藝研究工程菌生長與表達主要影響