【正文】 避免這種情況的發(fā)生，我們采用一種稱為集群分析（cluster analysis）的新方法。 圖57 散點圖統(tǒng)計結(jié)果 另一個分析方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門。 圖55 直方圖統(tǒng)計結(jié)果 二維點圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個點表示一個或多個細胞。右圖中M2為CD3 FITC陽性峰。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計表以輸出結(jié)果。 圖53 選定淋巴細胞亞群設(shè)門 門內(nèi)細胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。 圖52 全血樣本中淋巴細胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖 習題：設(shè)門 1 設(shè)門的方法通常用于分析樣本內(nèi)的指定細胞。 2 二維點圖用于顯示 參數(shù)。通道右側(cè)信號的熒光強度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強。 數(shù)據(jù)采集存儲完畢后，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。 流式細胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標準格式存儲，該標準由“分析細胞學協(xié)會”制定。如果設(shè)置了兩個閾值，那么粒子必須同時滿足兩個閾值的要求才會被當作信號細胞處理。每次只能有一個設(shè)閾參數(shù)。 2 敏感度高的 收集SSC光信號和熒光信號。對數(shù)放大（Log）常常用于把陰性信號從微弱的陽性信號中分離出來；而線性放大（Lin）通常用于放大散射光信號和熒光信號。 粒子進入照射區(qū)開始散射光或熒光時產(chǎn)生充電脈沖，首先光信號或光子由光電倍增管（PMTs）或光電二極管轉(zhuǎn)換成相應的電信號，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)由放大器，轉(zhuǎn)換成充電脈沖。 4 濾片允許特定波長及以下的光通過，而 濾片允許特定波長及以上的光通過。大于560nm的波長被反射。（見圖44）。BP 500/50則表示其允許通過波長范圍為475nm525nm。在光電倍增管（PMTs）前設(shè)置濾片可以使相當窄的一波長范圍內(nèi)光通過，提高了熒光信號的純度和強度，因而每個檢測器只有一種指定波長的熒光信號進入而被檢測，使光譜帶寬接近熒光染料的發(fā)射峰值。 4 在臺式機中，固定的 能夠保證激光截取 的位置是不變的。大型機的光平臺系統(tǒng)見圖43。圖41和圖42分別為臺式機 FACS Calibur 和 BD LSR 的光平臺系統(tǒng)。光學收集器則由若干透鏡組成，用于收集粒子發(fā)射的光束激光束相互作用，透鏡組和濾片發(fā)送激光束至相應的光學探測器。 6 流式細胞儀最常用的兩種熒光素是 和 。 2 熒光物質(zhì)能被激光激發(fā)出熒光的波長范圍稱為 。8． 每一個多色分析的實驗，都需要進行補償?shù)恼{(diào)整。在某些流式細胞儀上，F(xiàn)L1和FL3不能直接進行補償。5． 使用雙色補償質(zhì)控樣本，微調(diào)補償。4． 使用熒光抗體逐個染色（單染），運行單染樣本，調(diào)整補償。流式細胞儀多色分析的補償調(diào)整步驟1． 根據(jù)實驗室要求，每日做儀器校正（calibration/standardization）。例如，在多色分析中，如果熒光染色細胞的補償設(shè)置不足，就可能在雙色登高圖上顯示出一個假的雙陽性群體，導致數(shù)據(jù)分析失誤。這些光譜的交叉重疊，會導致熒光信號被相應檢測器以外的錯誤的檢測器探測到。 單克隆抗體偶聯(lián)上熒光素fluorescein isothiocyanate（FITC）、Rphychoerythrin（RPE）以及CyChrome，就可以用來檢測某一細胞群的多種抗原特性了。而且，還可以對感興趣的細胞進行再分選。被檢測到的熒光信號數(shù)量與粒子中標記上的分子數(shù)量成正比。這兩種熒光素的發(fā)射光譜如圖34所示。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號愈強。 能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長范圍稱為激發(fā)光譜。 7 和 雙參數(shù)的組合可區(qū)分不同種類的細胞亞群。2 光散射信號與細胞的哪些特性有關(guān)。 側(cè)向角散射：側(cè)向角散射（SSC）光與被測細胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感（見圖31）。散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(shù)（如染色），因此被稱為細胞的物理特性，即細胞的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 10 加大流速會降低檢測分辨率。 5 鞘液環(huán)包樣品并使之居中的過程稱為 效應。當液柱變寬時，一些流經(jīng)激光束的細胞會偏離中心，光斑也會偏離理想角度，這在一定程度下是允許的。大型機：單個細胞懸液從噴嘴噴出后，粒子或細胞在流動室外與激光相交（圖22）。 流動室內(nèi)充滿鞘液，根據(jù)層流原理，在鞘液的約束下，細胞排成單列出流動室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細胞液柱。而且在特定時間內(nèi)，應該只有一個細胞或粒子通過激光束。（4） 儀器功能鍵設(shè)置在“STANDBY”10分鐘左右。氣壓閥置于加壓位置，待流式細胞儀處于STANDBY狀態(tài)，做Prime，以排除管路中氣泡。 單個粒子通過其表現(xiàn)出的光散射和熒光屬性，通過列表模式（List mode）完成數(shù)據(jù)采集，并對樣本中的細胞亞群進行分析。被液滴包繞的粒子稱為細胞液柱，當粒子經(jīng)過激光照射區(qū)時，通過激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。電系統(tǒng)：把光信號轉(zhuǎn)換為電信號。液流系統(tǒng)：依次傳送待測樣本中的細胞到激光照射區(qū)。目 錄第1章 綜述…………………………………………………………………… 4 第2章 液流系統(tǒng)……………………………………………………………… 第3章 散射光信號及熒光信號……………………………………………… 散射光信號……………………………………………………… 熒光信號………………………………………………………… 熒光補償?shù)?章 光電系統(tǒng)……………………………………………………………… 光平臺…………………………………………………………… 光學濾片……………………………………………………… 信號探測器…………………………………………………… 閾值………………………………………………………………第5章 數(shù)據(jù)分析……………………………………………………………… 數(shù)據(jù)采集及顯示………………………………………………… 設(shè)門……………………………………………………………… 細胞亞群的數(shù)據(jù)分析………………………………………… 流式細胞儀其它應用的數(shù)據(jù)分析……………………………… CellQuest軟件使用…………………………………………… MutiSet軟件使用……………………………………………… Simultest軟件使用…………………………………………… B27軟件使用………………………………………………… WinMDI軟件使用………………………………………… FACSPress軟件使用………………………………………… System II軟件使用………………………………………… MultiCycle軟件使用………………………………………… Modfit使件使用……………………………………………第6章 流式基本檢測項目 淋巴細胞亞群檢測 （雙色、三色、四色，三種軟件分析） B27的檢測……………………………………………………… 血小板抗體檢測……………………………………………… 網(wǎng)織血小板及紅細胞分析…………………………………… 干細胞檢測…………………………………………………… DNA倍體分析…………………………………………………… 凋亡檢測…………………………………………………………第7章 分選 分選……………………………………………………………… 第8章 激光器及光路校正…………………………………………………… 激光器的工作原理……………………………………………… 光路校正…………………………………………………………第9章 答案………………………………………………………………培訓人：受訓人：培訓情況：培訓日期：第一章 綜 述流式細胞術(shù)是一項快速檢測分析單個粒子多物理特性的高技術(shù)，通常指細胞通過激光束時在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及相對的熒光強度。流式細胞儀培訓手冊Version 1200922蘇州市躍亞生物技術(shù)有限公司序 論學習儀器的最好方法是操作儀器，然而在理解原理的基礎(chǔ)上進行儀器操作無疑會起到事半功倍的作用。通過光電系統(tǒng)記錄細胞的散射光信號和熒光信號可得知細胞特性。對于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。含有熒光的粒子就會表現(xiàn)出其熒光特性。開機程序：檢查鞘液桶和廢液桶。關(guān)機程序：（1） 選關(guān)閉計算機。（5） 關(guān)閉流式細胞儀主機開關(guān)。 因此，必須在流動室內(nèi)把細胞注入鞘液流。這種同軸流動的設(shè)計，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)，這個過程稱為流體聚焦。臺式機：單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出，粒子或細胞在流動室內(nèi)與激光相交（圖21）。且樣本壓力連續(xù)可調(diào)。低流速促使樣本流變窄，單個細胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細胞可流經(jīng)激光束的中心，細胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測分辨率要求高的實驗，如DNA分析。 6 什么調(diào)節(jié)器可以控制細胞液柱的寬窄？ 7 對于臺式機，樣本的固定壓力是多少。（對 錯） 11 定性檢測時可使用高流速。散射光與細胞膜，核膜以及細胞結(jié)構(gòu)的折射性、顆粒性密切相關(guān)，細胞形狀和表面形貌也對其產(chǎn)生影響。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號。 3 與激光束方向相同的光散射稱為 散射。 熒光信號 熒光物質(zhì)吸收符合其波長范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級。因為更多的能量消耗在吸收轉(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。FITC的激發(fā)光譜如圖33所示， 488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時會表現(xiàn)出最強熒光信號，而當FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長激發(fā)時，也會檢測到熒光，但信號強度不會這么高。雖然PE的激發(fā)光譜的峰值不是488nm，但也足以檢測到熒光。 圖34 FITC、PE、PerCP、APC染料的發(fā)射光譜 圖35 熒光標記抗體對細胞表面抗原的特異性結(jié)合 對單克隆抗體進行熒光染色，通過分析細胞表面抗原標記確認細胞類型（見圖35）。 熒光補償使用流式細胞儀進行多色分析時，由于熒光發(fā)射光譜的重疊，需要做補償調(diào)整 在流式細胞儀上進行多色免疫熒光分析時，使用的不同熒光素的發(fā)射光譜有重疊現(xiàn)象，如果不對這種現(xiàn)象做適當?shù)恼{(diào)整，就會導致某一熒光素發(fā)出的熒光被其它“錯誤”的檢測器檢測到。在做這樣的多色分析時，使用同一波長的激發(fā)光（488nm），即15毫瓦氬離子激光。因此，要使用補償?shù)霓k法校正這種信號重疊導致的錯誤。在三色熒光分析時，為了防止由于補償造成的錯誤，應該使用單染細胞調(diào)整補償（另外兩種熒光為陰性對照），即用每一個熒光抗體單染細胞，然后調(diào)整每兩種顏色之間的補償。2． 檢測一個未染色樣本（自發(fā)熒光），調(diào)整前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC設(shè)置，使測定細胞群體顯示好，并可以按要求設(shè)門。監(jiān)測雙色點圖，調(diào)整補償設(shè)置（pensation settings），使染色陽性細胞和未染色陰性細胞在橫軸水平，在縱軸垂直。用①FITC和PE單克隆抗體，②PE和CyChrome單克隆抗體染色，最好使用單克隆抗體和同型對照染互斥的單陽性細胞群體。因此，做雙色分析時，不需要做FITC/CyChrome補償對照管。因此，每做一種多色分析的實驗，都要用單染和雙染對照樣本，按照37步做實驗條件的調(diào)整。 3 由熒光染料發(fā)射的波長稱為 。 7 熒光素標記抗體用于檢測 。光平臺的設(shè)計可實現(xiàn)以上功能。 圖41 臺式機 FACS Calibur 光平臺系統(tǒng)圖42 臺式機 BD LSR光平臺系統(tǒng)在大型機中，當液流流過噴嘴時，激光束通過消色差透鏡組以最佳角度和位置截取液流。圖43 大型機 FACS Vantage SE 光平臺系統(tǒng) 習題：光學平臺 1 光平臺為激光器與 提供了一個固定平面。 光學濾片 當細胞或粒子流過激光照射區(qū)時，SSC和熒光信號很弱，需要使用光電倍增管（PMTs）收集，而FSC信號很強，由光電二極管收集即可。這種濾片稱為帶通（BP）濾片。 流式細胞儀中常用的濾片還有長通濾片（LP）和短通濾片（SP），長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。 分光器的主要作用是完成光的收發(fā)。圖 44 光線通過長通濾片、短通濾片及帶通濾片的波長范圍 習題 ：光學濾片 1 檢測器前放置濾片作用是什么。 光電探測器 處在液流中的粒子通過激光束時產(chǎn)生光信號，這些光信號通過光電探測器轉(zhuǎn)換成電信號（電壓），然后到相應的通道。當粒子位于激光束正中時，脈沖最大，熒光最強。 充電脈沖通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器把01000mV的脈沖轉(zhuǎn)換成為代表01,000mV通道的數(shù)值。 3 探測器產(chǎn)生電流，經(jīng)由放大器轉(zhuǎn)換成電壓。如：對免疫表型實驗，閾值應設(shè)為FSC，以消除低于閾值道數(shù)的碎片。 習題：閾值 1 FSC閾值用于消除 信號。根據(jù)FSC標準，數(shù)據(jù)存儲格式應包括三個文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。單參數(shù)如FSC或FITC（FL1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道。 圖51 流式數(shù)據(jù)分析圖雙參數(shù)可在二維散點圖中同時顯示，X軸顯示通道1（FL1），Y軸顯示通道2（FL2）。 3 在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表