【正文】 品（ ng/mL，6樣本，其中兩樣本為標(biāo)準(zhǔn)曲線Sd7）和空白血漿樣品（6樣本）交替進(jìn)樣。按“方法準(zhǔn)確度與精密度”項(xiàng)下的方法配制低、中、高三濃度的QC樣品（各1個樣本），每個樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，計算血漿樣品的濃度，求得重復(fù)進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和精密度。表5 AAAA的定量下限血漿樣品濃度（ng/mL）RE%RSD%LLOQ1LLOQ2LLOQ3LLOQ4LLOQ5取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，、 ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿樣品的濃度，求得方法的準(zhǔn)確度與精密度。三天方法學(xué)確證的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表4，方法學(xué)確證的典型曲線見圖3。上述色譜圖結(jié)果表明， min左右， min左右，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾AAAA和內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)的測定（Ⅰ為AAAA，Ⅱ?yàn)閮?nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)）。全掃描圖如圖1所示。m） 大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司預(yù)柱： ODS C18保護(hù)柱（10 mm） 大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司流動相：甲醇水（84:16，v/v）流速： mL/min進(jìn)樣量：5 mL柱溫： 30℃ 質(zhì)譜條件ESI源CDL溫度： 200℃加熱塊溫度： 200℃霧化氣N2流速：反吹氣N2流速：檢測電壓： 檢測方式：負(fù)離子 掃描方式：選擇離子監(jiān)測m/z （AAAA）， m/（內(nèi)標(biāo)） 取血漿樣品100 μL，加入甲醇20 μL以甲醇水（50: 50,v/v）稀釋儲備液Ⅰ，配制AAAA標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，如表3所示。服藥后2h可飲水，4h進(jìn)統(tǒng)一清淡飲食。11. 給藥劑量及給藥途徑根據(jù)《中國藥典臨床用藥須知》2005年版（化學(xué)藥和生物制品卷）及有關(guān)生物等效性研究的文獻(xiàn)資料[2 ~5]，確定給藥劑量為單次口服100mg。 入選及體檢情況入選的20名健康男性志愿受試者在被告知所有與藥物有關(guān)的可能不良反應(yīng)后，簽署知情同意書。 終止試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)1. 在擬用的治療劑量下，出現(xiàn)了嚴(yán)重不良反應(yīng)（危及生命，或影響正常的一般性工作和生活），應(yīng)終止全部試驗(yàn)；2. 在擬用的治療劑量下，多數(shù)受試者出現(xiàn)中度不良反應(yīng)，應(yīng)終止全部試驗(yàn)。4. 入選前3個月內(nèi)，參加過另一藥物試驗(yàn)者。 不符合上述條件之一者，不得作為受試者入選。5. 試驗(yàn)前2周內(nèi)未服過任何其他藥物。9. 受試者選擇 入選標(biāo)準(zhǔn)1. 健康志愿者，男性，年齡18~40歲，且同一批受試者的年齡不宜相差10歲。將招募的符合入選標(biāo)準(zhǔn)的20名健康男性志愿受試者隨機(jī)分配至2組，每組10人，按表1以相同劑量（100mg）進(jìn)行給藥，每位受試者均分別交叉口服受試制劑和參比制劑，進(jìn)行交叉對照和自身對照。研究用藥由該藥理基地專人負(fù)責(zé)接收并對其進(jìn)行編碼和保管。6. 試驗(yàn)管理主要研究者接到遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥理基地臨床試驗(yàn)任務(wù)后，依據(jù)申辦者提供的資料及查閱參考文獻(xiàn)后，召開臨床試驗(yàn)方案討論會，與申辦方共同撰寫臨床試驗(yàn)方案、病例報告表及知情同意書，經(jīng)質(zhì)量保證部門審查合格后提交倫理委員會審核，并在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)備案。本品口服吸收迅速完全，健康志愿者口服AAAA片100mg后，～，～，食物對其吸收速度均無明顯影響，相對生物利用度為54%～96%；口服吸收后，廣泛與血漿蛋白結(jié)合，%～%，主要分布在細(xì)胞外液，～。2. 倫理學(xué)和有關(guān)指導(dǎo)原則赫爾辛基宣言（當(dāng)前版本）國際協(xié)調(diào)會（ICH）的GCP原則中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）頒布的GCP原則中華人民共和國藥品管理法本試驗(yàn)嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言的有關(guān)倫理準(zhǔn)則，試驗(yàn)方案經(jīng)獨(dú)立倫理委員會（IEC）審核批準(zhǔn)。主要藥代動力學(xué)參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，并進(jìn)一步采用雙單側(cè)t檢驗(yàn)和[12α]置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評價，其中Tmax采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。 ngh/mL；參比制劑AAAA的t1/2：177。Cmax： 177。由血藥濃度時間數(shù)據(jù)，獲得受試制劑和參比制劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)，采用方差分析和雙單側(cè)檢驗(yàn)法進(jìn)行生物等效性判定。用HPLCMS法測定血漿中AAAA的濃度，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品測定。 ng/mL，Tmax： 177。 h，Cmax：177。h/mL。結(jié)果表明，BBB制藥有限公司研制的AAAA（受試制劑）的AUC0t、AUC0∞和Cmax均拒絕生物不等效假設(shè)。實(shí)驗(yàn)開始之前，研究人員向受試者說明試驗(yàn)藥物的性質(zhì)，試驗(yàn)的目的、方法、試驗(yàn)的風(fēng)險和自愿參加的原則，并獲得受試者的書面知情同意書。由BBB制藥有限公司生產(chǎn)的AAAA分散片（受試制劑），已經(jīng)由國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)進(jìn)行臨床研究。經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)后，由主要研究者主持召開臨床試驗(yàn)啟動會，對參加本次試驗(yàn)的所有人員實(shí)施GCP培訓(xùn)，制訂試驗(yàn)過程中的監(jiān)查、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制、統(tǒng)計/數(shù)據(jù)管理、嚴(yán)重不良事件的報告等相關(guān)的各種標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對研究中可能發(fā)生的問題制訂其處理措施。研究用藥的領(lǐng)取根據(jù)參加試驗(yàn)的受試者人數(shù)，由研究者在試驗(yàn)當(dāng)天領(lǐng)取試驗(yàn)藥物，保管人員詳細(xì)記錄并由研究者簽名和注明日期。交叉服藥前有一周清洗期。2. 體重指數(shù)（BMI）在19~24〔BMI=體重kg/(身高m)2〕之間。6. 3個月內(nèi)無獻(xiàn)血史。 排除標(biāo)準(zhǔn)1. 篩選時體格檢查，實(shí)驗(yàn)室檢查或心電圖檢查異常。5. 試驗(yàn)前2周內(nèi)服用過影響試驗(yàn)的其他藥物。 替換原則退出、脫落或被剔除的受試者可進(jìn)行替換。受試者全面體格檢查均正常（其中包括腎功能、肝功能、血常規(guī)及尿常規(guī)等體格檢查指標(biāo)）。服藥前禁食過夜10h以上，試驗(yàn)日晨空腹口服受試制劑1片（100mg /片）或參比制劑1片（用250 mL溫開水送服），并做記錄。， h取靜脈血，每一階段總計取13個點(diǎn)（每點(diǎn)取血5 mL）。表3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液稀釋過程AAAA（μg/mL）Sd7儲備液Ⅰ, mL→10 mLQC3儲備液Ⅰ, mL→10 mLSd6儲備液Ⅰ, mL→10 mLSd5儲備液Ⅰ, mL→10 mLQC2儲備液Ⅰ, mL→50 mLSd4QC2, 6 mL→10 mLSd3QC2, 2mL→10 mLQC1QC2, 1mL→10 mLSd2QC2, →10 mLSd1QC2, →10 mL 取內(nèi)標(biāo)對照品約10 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋，加二氯甲烷乙酸乙酯（4:1，v/v）2 mL，渦旋混合3 min，離心5 min（4000 rpm），分取有機(jī)相，于空氣流下吹干，殘渣用流動相定容至2mL，超聲5 min，渦旋 3min，轉(zhuǎn)移至EP管中，離心3 min（12000 rpm），取5181。圖1 AAAA（A）和內(nèi)標(biāo)（B）的全掃描質(zhì)譜圖精密量取6名受試者的空白血漿100 181。 空白血漿樣品色譜圖圖 空白血漿樣品加對照品色譜圖 取空白血漿100 μL，分別加入AAAA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，, ， ng/mL的血漿樣品，按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，制備AAAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線（方法確證）測 日線性血漿樣品濃度（ng/mL）第一天Y = 104 X 104R = 第二天Y = 104 X+104R = 第三天Y = 104 X +103R = MeanSD日內(nèi)RSD（%） 日間RSD（%） RE（%）Y = 104 X 104R = 圖3 HPLCMS法測定血漿中AAAA的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線（方法學(xué)確證第一天） 定量下限取空白血漿100 μL，加入AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液（ ng/mL）20 μL， ng/mL的血漿樣品（5樣本），按“血漿樣品預(yù)處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每一樣本測得濃度。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的HPLCMS法測定的日內(nèi)和日間精密度的RSD%達(dá)到試驗(yàn)要求[1]。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的HPLCMS法重復(fù)進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和精密度達(dá)到試驗(yàn)要求。結(jié)果表明，本試驗(yàn)所建立的HPLCMS法AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）均無殘留。L和內(nèi)標(biāo)溶液50 181。詳見表8。L和內(nèi)標(biāo)溶液50 181。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算基質(zhì)效應(yīng)。取空白血漿100 μL，分別加入不同濃度的AAAA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL， , ng/mL的血漿樣品（每濃度5樣本），在室溫下放置24h后，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)。結(jié)果表明，AAAA血漿樣品預(yù)處理后在進(jìn)樣器中（4℃）放置6h穩(wěn)定。第二次在室溫自然解凍，再放回20 ℃下冷凍不少于12h，第三次在室溫自然解凍后，按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下同法試驗(yàn)。結(jié)果表明，于冰箱20℃保存的AAAA血漿樣品在45天內(nèi)穩(wěn)定。于方法學(xué)第一天分別稱取AAAA對照品和內(nèi)標(biāo)對照品，同法配制供儲備液穩(wěn)定性分析的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別制備供儲備液穩(wěn)定性分析的AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)曲線3,4Y=103 (3)Y=105X+103 (4)取十天前配制的樣品1和樣品2，分別進(jìn)樣，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(3), (4)計算各自的濃度；將兩次測得的樣品1和樣品2的濃度分別進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，AAAA與內(nèi)標(biāo)溶液兩次測得濃度間的差異無統(tǒng)計意義（Sig. ），AAAA和內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)）溶液在4 ℃保存十天穩(wěn)定。14．?dāng)?shù)據(jù)