抗癌的吲哚酚類通過(guò)抑制硫氧還原蛋白酶和活化信號(hào)的氧化還原來(lái)誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞的凋亡論-wenkub
2023-01-23 08:23:05 本頁(yè)面
【正文】 2）；】被合成 2） 重組人 NRH:醌氧化還原酶 2（ NQO2）自 SigmaAldrich（圣路易斯，密蘇里州）得到。Saitoh et al., 1998). 我們之前的研究表明靶位點(diǎn) TR1可能是引起 IQ 毒性的潛在機(jī)制。Abate et al., 1990。 首先，硫氧還蛋白參與抗氧化防御，主要通過(guò)作為對(duì)硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶的電子供體，用巰基以清除氧化劑 (Berggren et al., 2022). 其次，降低的硫氧還蛋白使得核糖核苷酸還原酶的相等的降低量，核糖核苷酸還原酶催化 核糖核苷酸轉(zhuǎn)化為脫氧核糖核苷酸（洛朗等人， 1964），是 DNA合成和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟之一。 IQs的NCI60作用模式和先前報(bào)道硫氧還蛋白還原酶抑制劑 4 （苯并噻唑 2 基） 4 羥基 2,5 環(huán)己二烯 1 酮（ AW464）的相似處（ Chew等人， 2022），引起一個(gè)猜想 —— 人 硫氧還蛋白系統(tǒng)可能是 IQs的分子靶。這些化合物共有吲哚酚類的骨架結(jié)構(gòu)，但是在醌環(huán)和吲哚環(huán)上有不同的取代。通過(guò) IQs，在 MIA PACA2細(xì)胞中， TR1的抑制導(dǎo)致了硫氧還蛋白 1的氧化還原狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸问揭约盎罨?p38和cJun NH2末端激酶（ JNK），促分裂原活化蛋白激酶（ MAPK）信號(hào)通路。通過(guò)測(cè)定 IC50， IQs在低納摩爾濃度下就表現(xiàn)對(duì)胰腺癌細(xì)胞系 MIAPaCa2 強(qiáng)有力的抗癌活性。 IQs50誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是時(shí)間和濃度依賴性的，而且和其他濃度依賴的抑制劑誘導(dǎo)生長(zhǎng)抑制的影響而言， IQs是 MIA PaCa2細(xì)胞中硫氧還原蛋白酶 1（ TR1）的強(qiáng)有力的抑制劑。氧化的硫氧還蛋白被認(rèn)為激活了細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1—— 是在 MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)中的 p38/JNK上游活化酶，這些已經(jīng)在研究中被證實(shí)，從而提供了 Q誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。兩類 IQs被發(fā)現(xiàn)是對(duì)各種人胰腺癌細(xì)胞系極其有效的藥物，達(dá)到IC50的生長(zhǎng)抑制時(shí)是在低的納摩爾濃度范圍，這兩類即為 2羥甲基類（例如 2羥甲基 5甲氧基 1甲基 3[(4硝基苯氧基 )甲基 ]吲哚 4,7二酮（ 1）； ] 和 2位未取代的吲哚酚類【如，5甲 氧基 1甲基 3【 (2,4,6三氟苯氧基）甲基】吲哚 4,7二酮（ 2）； Fig,1】。 細(xì)胞質(zhì)硫氧還蛋白系統(tǒng)，包括硫氧還蛋白 1，硫氧還蛋白還原酶 1（ TR1），和 NADPH，在維持細(xì)胞內(nèi)的蛋白的硫醇的氧化還原平衡中（ Arne39。 第三，硫氧還蛋白調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 DNA的活性，如糖皮質(zhì)激素受體，轉(zhuǎn)錄因子 IIIC， 核因子 B， p53和激活蛋白 1（ FOS/Jun） ,通過(guò)他們的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域處的半胱氨酸殘基的氧化還原調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)。 Matthews et al., 1992。在這項(xiàng)研究中，我們?cè)谌艘认侔┘?xì)胞中闡明了 TR1作為 IQs的靶位點(diǎn)。 3） 核苷（ NRH）合成在我們的實(shí)驗(yàn)室中使用發(fā)布程序（。 10） 膜聯(lián)蛋白 V染色試劑盒和 EnzChek熒光 Caspase3活性試劑盒購(gòu)自 Invitrogen公司（卡爾斯巴德獲得， CA）中。細(xì)胞保持在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中含有 5％二氧化碳， 37℃。 4）去除培養(yǎng)基， 50 微克 MTT添加到 50微 升的完全培養(yǎng)基后，添加到每一孔中，再孵化 4小時(shí)。藥物處理后，將細(xì)胞收集，用 PBS洗滌，重懸在膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液和膜聯(lián)蛋白 V異 硫氰酸熒光素和 PI中，根據(jù)廠商的說(shuō)明。 caspase3活性測(cè)定 1)caspase3的活性測(cè)定使用 EnzChek caspase3的測(cè)定按照試劑盒（ Invitrogen公司 )制造商的說(shuō)明。 5分鐘后，在冰上溫育后，將樣品 以 1000g離心 5分鐘。 （ 1951）。 4） 活性測(cè)定混合物含有 100mM的磷酸鉀緩沖液， ， 2mM EDTA 的， 1毫克 /毫升牛血清白蛋白， 250 M + NADPH和 DTNB。 2） 40微升溶液中包含了 50mM 磷酸鉀緩沖液， pH為 ， 1mMEDTA, NQO2，200微末 NRH,9g的 TRQ,250微摩 NADPH，在室溫下孵育 15分鐘。 7） 消化產(chǎn)品使用 SpeedVac中（默飛世爾科技，沃爾瑟姆干燥， MA）和重新溶解在％三氟乙酸。 10） 樣品采用納米注射器手動(dòng)注入 （瓦爾科儀器有限公司，休斯頓，德克薩斯州）到， 150毫米 18的 MS柱（格雷斯性 Vydac， Hesperia的， CA）。 使用 ProteinProspector計(jì)算的 C末端肽的理論同位素的分布 細(xì)胞中 TR1活性 1） 將細(xì)胞收集到的 RIPA緩沖液中， 超聲處理，然后離心（ 13000 rpm離心 ? 15分鐘），在上清液中的蛋白質(zhì)的濃度用洛瑞的方法求得 2） 然后在 96孔板中進(jìn)行 TR1活性測(cè)定，利用一個(gè)端點(diǎn)胰島素減少測(cè)定法如先前所述（ Fang等人， 2022）。空白測(cè)定各樣品，含一切除硫氧還蛋白，以相同的方式進(jìn)行處理，從相應(yīng)的樣品的值吸光度中減去并空白值。 細(xì)胞超聲波處理后， NADPH的消耗相當(dāng)于在 340nm處吸光度的減少，在 1 mM的 GSSG的存在或不存在的情況下。加入細(xì)胞超聲處理物并孵育 1 分鐘。 GSH和 GSSG在
公司管理相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1