蛋白質(zhì)含量測定方法匯總(已修改)
2025-11-12 22:17 本頁面
【正文】 實驗七蛋白質(zhì)含量測定測定蛋白質(zhì)的定量方法有很多，目前常用的有染料法，雙縮脲(Biuret)法，酚試劑法(Lowry)法及紫外吸收法。[目的要求]1．掌握測定蛋白質(zhì)的含量基本方法。2．了解染料法、雙縮脲法、Lowry法和紫外吸收法測定原理。一、染料法[實驗原理]在酸性溶液中染料考馬斯亮藍G250與蛋白質(zhì)結(jié)合，此時考馬斯亮藍G250顏色從紅色變?yōu)樗{色，吸收高峰從460nm移至595nm。利用這個原理可以測定蛋白質(zhì)含量。該法近年在某些方面有取代經(jīng)典的Lowry法趨勢，因為它操作簡單，反應時間短，染料蛋白質(zhì)顏色穩(wěn)定，抗干擾性強。本法的缺點是：對于那些與標準蛋白氨基酸組成有較大差異的蛋白質(zhì)，有一定誤差，因為不同的蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合是不同的，故該法適合測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相近的蛋白質(zhì)。[器材]吸量管； 試管；721型分光光度計[試劑]：。：稱取考馬斯亮藍G250%的酒精50ml，再加入85%的濃磷酸100ml，用水稀釋至1000ml,混勻備用。[操作步驟]1．標準曲線的繪制：試劑(ml)\管號012345標準蛋白溶液0H2O0染料溶液A595nm按上表分別向各支試管內(nèi)加入各種試劑，充分混勻，5min后在595nm波長處以0號管調(diào)零,測定各管吸光度值（A）。以吸光度值為縱坐標,蛋白質(zhì)濃度為橫坐標繪制標準曲線。2．樣品測定：取1ml樣品溶液（約含25～250微克蛋白質(zhì)），加入染料溶液5ml混勻，5min后測定其595nm吸光度值，對照標準曲線求得蛋白質(zhì)濃度。二、雙縮脲(Biuret)法測定蛋白質(zhì)含量[實驗原理]在堿性溶液中，雙縮脲(H2NCONHCONH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡合物，這一反應稱雙縮脲反應。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(—CONH2)，或與此相似的基團[如—CH2NH2，—CSNH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應。蛋白質(zhì)分子含有眾多肽鍵(—CONH—)，可發(fā)生雙縮脲反應，且呈色強度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。測定范圍為1～10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。[試劑]1．雙縮脲試劑： 取CuSO45H20(.)(.)，／LNaOH溶液300ml，KI，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現(xiàn)，即不能使用。2．標準蛋白質(zhì)溶液： 用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10g/L的標準蛋白溶液，可用BSA濃度1g/。如有需要，標準蛋白質(zhì)還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱
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