【正文】 1 1 引言 昆蟲綱是動(dòng)物界種類最豐富的一個(gè)類群，研究昆蟲的系統(tǒng)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育對(duì)了解生物進(jìn)化以及進(jìn)化機(jī)制都有重要意義。 葉蜂總科 (Tenthredinoidea)隸屬于昆蟲綱膜翅目 (Hymenoptera)廣腰亞目 (Symphyta)，種類極多，分布廣泛。葉蜂科是葉蜂總科最大的科，大概有 7000 余種，已知 5000 種以上，中國(guó)種類超過(guò) 300屬 2000 種 ,這個(gè)類群對(duì)農(nóng)、林害蟲種群控制和保持生態(tài)平衡起到一種關(guān)鍵性的自然調(diào)控作用。長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)的葉蜂分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究主要依賴于形態(tài)解剖特征、生物學(xué)性狀以及生物地理學(xué)信息 等，因?yàn)橥獠啃螒B(tài)等比較直觀，容易得到。這些分類依據(jù)在大多數(shù)情況下能清晰地反映一個(gè)物種的分類地位或系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 [13]。 傳統(tǒng)的昆蟲系統(tǒng)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究主要依賴形態(tài)解剖特征、生物學(xué)性狀以及生物地理學(xué)信息等，這些依據(jù)在大多數(shù)情況下能清晰的反映一個(gè)物種的分類地位或系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。但隨著學(xué)科的發(fā)展也遇到了一些傳統(tǒng)方法難以解決的困難，例如，一些近緣種很難確定其分類地位，對(duì)于種群、生態(tài)型的研究更是如此。生物大分子如 DNA 和蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)所必需，其中核酸攜帶了生物的所有遺傳基因。 Berlocher(1984)以昆蟲分子系 統(tǒng)學(xué) [4]（ insect molecular systematics）為題首次專門介紹了分子技術(shù)在昆蟲系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用及其數(shù)據(jù)分析方法。 20年來(lái)，昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)快速發(fā)展， 目前應(yīng)用核酸序列分析技術(shù)測(cè)定昆蟲特定的核苷酸序列，以比較不同昆蟲之間的演化關(guān)系，建立符合自然發(fā)育的分子系統(tǒng)譜系，是昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育方面的主要研究方向之一。 COI 基因是 mtDNA13 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之一。該基因的產(chǎn)物是細(xì)胞色素氧化酶亞基 I，后者是細(xì)胞色素氧化酶的重要組成部分。細(xì)胞色素氧化酶在呼吸鏈電子傳遞和質(zhì)子的跨膜反應(yīng)中發(fā)揮著巨大作用， 在真核生物中它由多個(gè)亞基組成，其中亞基 I， II 和 III 由線粒體 DNA 編碼，其余為核基因編碼。這些亞基多為跨膜蛋白，跨過(guò)線粒體的內(nèi)膜，亞基 I 和 11 組成酶的催化核心。 Col 是細(xì)胞色素 C氧化酶中最大和最保守的 亞基，葉蜂中 COl 全長(zhǎng) 860bp。 研究葉蜂亞科生物學(xué)一方面在生產(chǎn)上有助于害蟲治理，另一方面，通過(guò)研究其系統(tǒng)演化及在各個(gè)地質(zhì)時(shí)期的分布變遷，研究其和寄主植物的協(xié)同演化關(guān)系，將有助于人類對(duì)自然界的演化規(guī)律、物種多樣性及地球表面環(huán)境變遷 (大陸漂移、陸地表面的升降等 )的認(rèn)識(shí)，有助于人類更好地保護(hù)和利用我們賴于生存的 環(huán)境。 2 研究背景及研究?jī)?nèi)容 在昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中主要應(yīng)用細(xì)胞核 DNA、 mtDNA 和 rDNA。其中細(xì)胞核 DNA 或 mtDNA 的序列分析是一項(xiàng)最急需的技術(shù)，它提供了大量的詳細(xì)資料。而 mtDNA 在進(jìn)化研究中非常有用，一直應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)和基因流、雜交、生物地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育的研究 [5 ]。 mtDNA 小、相對(duì)快的進(jìn)化速率和母本的遺傳特性使得它很適合于種群歷史和親緣關(guān)系相近的分類單元間進(jìn)化的研究 [6—8 ]。mtDNA 主要用于 RFLP 和克隆后或 PCR 擴(kuò)增后的測(cè)序 [9—10 ]。 核基因序列 生物 的性狀基本由核基因決定。核基因中含有更加豐富的生物學(xué)信息，用適當(dāng)?shù)暮嘶蜓芯坷ハx的系統(tǒng)發(fā)育，其結(jié)果更有可能比較真實(shí)地反映出昆蟲的進(jìn)化歷史。核基因有以下優(yōu)點(diǎn)： 1)核基因一般比線粒體基因進(jìn)化得慢，這使它們成為一種解決分歧久遠(yuǎn)的類群關(guān)系比較好的標(biāo)記； 2)核基因構(gòu)建的樹普遍有比較高的CI 值，與線粒體基因相比更有助于整棵樹的解決； 3)核基因的堿基位點(diǎn)速率變異有更高的同質(zhì)性； 4)核基因的堿基替代速率距陣比線粒體基因的要均勻。 細(xì)胞色素 b 是一個(gè)橫貫?zāi)蓚?cè)的極端疏水性的蛋白。對(duì)細(xì)胞色素 b 氨基酸組成和結(jié)構(gòu)基因的 脫氧核糖核酸 (DNA)順序研究指出 ,約 68％的氨基酸為非極性的。對(duì)細(xì)胞色素 b 在電子傳遞鏈中的復(fù)雜功能至今還不清楚。 線粒體基因 (mtDNA)序列 mtDNA 廣泛存在于昆蟲體內(nèi)富含線粒體的飛行肌中和卵內(nèi) ,昆蟲的 mtDNA 大小一般為 1514～ 1613 kb，以高拷貝數(shù)目存在于線粒體內(nèi)。相對(duì)于核 DNA 來(lái)說(shuō)， mtDNA 是一個(gè)封閉的環(huán)狀雙鏈，核酸序列和組成比較保守，以它作為模板制作的 PCR 反應(yīng)引物的通用性比較強(qiáng)。對(duì)進(jìn)化過(guò)程中不同生物體的 DNA 序列的核苷酸替換率的比較研究發(fā)現(xiàn)， mtDNA 基因組的替換率比核 DNA 高 5～ 10 倍。 mtDNA 基因組中不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，無(wú)重復(fù)序列和不等交換，在遺傳過(guò)程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變，并且遵守嚴(yán)格的母系遺傳方式，可以簡(jiǎn)單地認(rèn)為 mtDNA 是克隆型。正是由于以上結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上的特點(diǎn)， mtDNA 已成為研究生物 (主要是動(dòng)物 ) 進(jìn)化的重要材料。 國(guó)內(nèi)已有很多學(xué)者利用 mtDNA 上的不同基因組對(duì)昆蟲綱內(nèi)不同分類階 (單 ) 3 元之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了研究。印紅 [11]將我國(guó)直翅目蝗總科 8 科 8 個(gè)種和從互聯(lián)網(wǎng) GenBank 中檢索到相關(guān)物種的線粒體基因組 16S rRNA 序列片段 進(jìn)行同源性比較，計(jì)算核苷酸使用頻率，并構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。胡婧 [12]年以網(wǎng)翅蝗科的 6 種昆蟲作為材料，通過(guò)特異性引物，對(duì) mt 16S rRNA 基因序列進(jìn)行了擴(kuò)增。劉殿鋒 [13]測(cè)定了斑腿蝗科 10 亞科 20 種蝗蟲和其他蝗科 3 種蝗蟲的線粒體 16S rRNA 部分序列，并從 GenBank 中下載了 15 種蝗亞目昆蟲的 16S rRNA 基因相應(yīng)序列片段。劉曉麗在 2020 年報(bào)道了 9 種擬步甲 16S rDNA 部分序列及其親緣關(guān)系，部分?jǐn)M步甲 16S rRNA 和和 18S rRNA 基因序列與分子系統(tǒng) [1415]。 現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，快 速進(jìn)化的基因或者核苷酸區(qū)段（如線粒體 DNA、線粒體的 rRNA 的 IGS 區(qū)域）適合于種內(nèi)或近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析；慢速進(jìn)化的基因（如核糖體 DNA 及其產(chǎn)物 rRNA）適合于遠(yuǎn)緣種類或高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育。有學(xué)者認(rèn)為，由于核基因沒有線粒體基因的替代偏異特征，昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)應(yīng)該更加關(guān)注核基因數(shù)據(jù)而不是線粒體基因數(shù)據(jù)。 總之，當(dāng)前運(yùn)用核基因序列或?qū)⒑嘶蛐蛄信c線粒體基因相結(jié)合研究昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育正成為該領(lǐng)域的一種發(fā)展趨勢(shì)。雖然應(yīng)用 DNA 序列分析等分子手段來(lái)探討昆蟲不同類群之間的系統(tǒng)關(guān)系是當(dāng)今昆蟲系統(tǒng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。但是目前在實(shí)驗(yàn)技術(shù)、資料積累、數(shù)據(jù)處理分析以及序列數(shù)據(jù)的可比性等方面還有待于進(jìn)一步的完善和充實(shí)。 分子系統(tǒng)樹構(gòu)建方法 分子系統(tǒng)學(xué)的主要目的是根據(jù)分子數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)樹，已有很多統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以用于分析分子數(shù)據(jù)來(lái)重建系統(tǒng)發(fā)育樹，通常使用的方法分為 4 類：距離法、簡(jiǎn)約法、似然法以及貝葉斯法。 距離矩陣法（ distance matrix method）首先獲得所有分類群間的進(jìn)化距離，再基于這些距離值之間的關(guān)系構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。包括兩種方法，①算術(shù)平均的不加權(quán)對(duì)群法（ UPGMA），類群間的距離是兩個(gè)類群內(nèi)所有成員成對(duì)距離的平均值，聚類結(jié)果可用樹狀圖表示，分支點(diǎn)是兩個(gè)序列間的中間點(diǎn)。一對(duì)序列間的距離是分支長(zhǎng)度的總和。②鄰接法（ neighber－ jointing method）原理是逐漸尋找新的近鄰，使最終生成的分支樹的總長(zhǎng)度達(dá)到最小。它只產(chǎn)生一個(gè)帶有分支長(zhǎng)度估計(jì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。 4 簡(jiǎn)約法（ parsimony method）中最大簡(jiǎn)約法是獲得最簡(jiǎn)約的進(jìn)化途徑。所產(chǎn)生的最大簡(jiǎn)約樹中，所有類群的性狀狀態(tài)的變化總數(shù)也最小。對(duì) DNA 序列而言，理論上每個(gè)位點(diǎn)均可以構(gòu)建三種可能的譜系樹，然而并非所有的位點(diǎn)都可用于重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?？捎糜跇?gòu)建最大簡(jiǎn)約樹的 位點(diǎn)稱為信息位點(diǎn)。 最大似然法（ maximum likelihood method， ML）對(duì)每個(gè)譜系拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，計(jì)算出可觀察到符合特定替代模式的一組特定的序列數(shù)據(jù)的最大概率（似然率），然后挑選最大似然值最高的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（樹＼分支圖）作為重建的譜系樹。以核酸替代模型為基礎(chǔ)， ML法需要確定每個(gè)分支在一定時(shí)間間隔內(nèi)核苷酸發(fā)生特定替代變化的概率。 貝葉斯法 [16]（ Bayesain analysis）建立在 ML基礎(chǔ)上的但比 ML更為捷徑的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，它采用了 ML法的基本原理，同時(shí)引進(jìn)了馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法 (the Markov Chain Monthe Carloanlysis， MCMC)途徑，將運(yùn)算效率提高，大大地縮短運(yùn)算時(shí)間，最終獲得一組似然率最大樹構(gòu)成的合意樹，直接估算貝葉斯后驗(yàn)概率 (Bayesain Posterior Probabilities)。 目前還沒有一種構(gòu)樹方法可以適合所有的數(shù)據(jù)和各種條件。在距離矩陣法中， UPGMA 法隱含了所有支系上速率相等的假設(shè)。鄰接法和轉(zhuǎn)換距離法不包括速率一致的假設(shè)，但均采用校正距離矩陣來(lái)減少各分支不同速率的影響。這些方法依賴校正距離系數(shù)的準(zhǔn)確性。當(dāng)序列之間的進(jìn)化速率差異很大 或替代型式不同時(shí)，同型事件出現(xiàn)的可能性就較大，這也直接限制了簡(jiǎn)約法的應(yīng)用。 Swofford[17]提出了最大簡(jiǎn)約法中轉(zhuǎn)換替代和顛換替代賦予不同權(quán)重的計(jì)算算法，但該方法仍需要假定轉(zhuǎn)換替代與顛換替代的比率。計(jì)算機(jī)模擬研究表明：在進(jìn)化速率恒定的前提下，最大似然法的結(jié)果質(zhì)量則依賴序列進(jìn)化模式的確定。在進(jìn)化速率可變的前提下，最大簡(jiǎn)約法略差于轉(zhuǎn)換距離法和鄰接法，最大似然法結(jié)果最優(yōu)。然而，如果轉(zhuǎn)換替代的頻率大大顛換替代時(shí)，鄰接法要優(yōu)于最大似然法的結(jié)果。 葉蜂科昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育研究現(xiàn)狀 一般認(rèn)為，葉蜂總 科包括三節(jié)葉蜂科 (Argidae),四節(jié)葉蜂科 /梨室葉蜂科（ Blasticotomidae),錘角葉蜂科（ Cimbicdae） ,松葉蜂科（ Diprionidae） ,筒腹葉蜂科（ Pergidae),葉蜂科 (Tenthredinidae)。研究葉蜂總科內(nèi)部的系統(tǒng)關(guān)系對(duì)解決整個(gè)廣腰亞目之間的關(guān)系有至關(guān)重要的作用。 2020 年 Schulmeister[1]提 5 出了葉蜂總科的系統(tǒng)關(guān)系 : （葉蜂科（不包括殘青葉蜂科） + 錘角葉蜂科 + 松葉蜂科）是單系群，并且作為（三節(jié)葉蜂科 + 筒腹葉蜂科）的姐妹群，顯然是葉蜂科的并系， 而去除殘青葉蜂科外的其余葉蜂科類群是單系 [17]。 Schulmeister對(duì)分子數(shù)據(jù)獨(dú)立分析所得葉蜂總科內(nèi)部的分支與 Vilhelsmsen 不同，也未出現(xiàn)Vespina。葉蜂總科內(nèi)的節(jié)點(diǎn)目前大部分還處于模糊狀態(tài)。 中國(guó)葉蜂研究的工作在新中國(guó)成立以后繁榮起來(lái)，葉蜂研究的工作者越來(lái)越多，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所的朱弘復(fù)、王林瑤、袁德成，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院的黃孝運(yùn)、周淑芷、肖剛?cè)?、吳?jiān)、張真等先后報(bào)道了中國(guó)一些葉蜂的新種 [1827]。蕭剛?cè)嵯壬?1991 年總結(jié)了中國(guó)葉蜂的系統(tǒng)分類研究成果 [28]。從 20 世紀(jì) 90年代 開始，中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲系統(tǒng)與進(jìn)化研究組的魏美才、聶海燕、張少冰、鐘義海、鄧鐵軍、陳明利、黃寧廷等都對(duì)中國(guó)葉蜂研究工作做出了突出貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大量新種，并建立了許多新屬。 2020 年魏美才等系統(tǒng)回顧了中國(guó)葉蜂系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)研究歷史，給出了中國(guó)葉蜂種類名錄和研究文獻(xiàn)目錄。 葉蜂總科是廣腰亞目最大的總科，中國(guó)己記載 6 個(gè)科，分別為三節(jié)葉蜂科Argidae，葉蜂科 Tenthredinidae，松葉蜂科 Diprionidae，錘角葉蜂科 Cimbicidae，筒腹葉蜂科 Pergidae 和茸蜂科 Blasticotomidae。 2 材料與方法 標(biāo)本及來(lái)源 本研究提取了葉蜂科昆蟲 10 個(gè)樣品的基因組 DNA，標(biāo)本是中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲系統(tǒng)與進(jìn)化生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室人員在野外采集的近三年標(biāo)本， 100% 酒精浸泡，﹣ 20℃保存。 魏美才博士 完成標(biāo)本鑒定。實(shí)驗(yàn)選取葉蜂成蟲胸部提取基因組DNA，殘骸繼續(xù)用酒精保存以做證據(jù)。提取的 DNA 和殘骸標(biāo)本均保存于中南林業(yè)科技大學(xué)昆蟲系統(tǒng)與進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室。 以蕨葉蜂亞科 Selandriinae、平背葉蜂亞科Allantinae、巨基葉蜂亞科 Megabelesesinae 及藺葉蜂亞科 Belesesinae 為內(nèi)群，從Genbank 下載 Runaria reducta 的 28S DNA 及 Cytb 基因序列做 為外群。樣本詳情見表 1。 6 表 1 蕨 葉蜂 亞 科 與其它各亞科 系統(tǒng)發(fā)育研究選用類群信息 specimens information of Tenthredinidae researched in this study 所屬類群 基因序列號(hào) 采集地點(diǎn) 采集時(shí)間 科 亞 科 屬 種 名 Cytb 28SrDNA in group Tenthredinidae Selandriinae Aneugmenus Aneugmenus frontalis 0 0 湖北宜昌神農(nóng)架 Aneugmenus pteridii 0 0 湖南東安舜皇山 Neostromboceros Neostromboceros nipponicus 0 0 湖南東安舜皇山 Euforsius Euforsius pieli 0 0 湖南瀏陽(yáng)大圍山 Allantinae Taxonus Taxonus attenatus 0 0 浙江臨安清涼峰 Lin