【正文】 育關(guān)系進(jìn)行了研究。劉曉麗在 2020 年報道了 9 種擬步甲 16S rDNA 部分序列及其親緣關(guān)系，部分?jǐn)M步甲 16S rRNA 和和 18S rRNA 基因序列與分子系統(tǒng) [1415]。雖然應(yīng)用 DNA 序列分析等分子手段來探討昆蟲不同類群之間的系統(tǒng)關(guān)系是當(dāng)今昆蟲系統(tǒng)學(xué)研究的熱點(diǎn)。包括兩種方法，①算術(shù)平均的不加權(quán)對群法（ UPGMA），類群間的距離是兩個類群內(nèi)所有成員成對距離的平均值，聚類結(jié)果可用樹狀圖表示，分支點(diǎn)是兩個序列間的中間點(diǎn)。 4 簡約法（ parsimony method）中最大簡約法是獲得最簡約的進(jìn)化途徑。 最大似然法（ maximum likelihood method， ML）對每個譜系拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，計算出可觀察到符合特定替代模式的一組特定的序列數(shù)據(jù)的最大概率（似然率），然后挑選最大似然值最高的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（樹＼分支圖）作為重建的譜系樹。在距離矩陣法中， UPGMA 法隱含了所有支系上速率相等的假設(shè)。 Swofford[17]提出了最大簡約法中轉(zhuǎn)換替代和顛換替代賦予不同權(quán)重的計算算法，但該方法仍需要假定轉(zhuǎn)換替代與顛換替代的比率。 葉蜂科昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育研究現(xiàn)狀 一般認(rèn)為，葉蜂總 科包括三節(jié)葉蜂科 (Argidae),四節(jié)葉蜂科 /梨室葉蜂科（ Blasticotomidae),錘角葉蜂科（ Cimbicdae） ,松葉蜂科（ Diprionidae） ,筒腹葉蜂科（ Pergidae),葉蜂科 (Tenthredinidae)。葉蜂總科內(nèi)的節(jié)點(diǎn)目前大部分還處于模糊狀態(tài)。 2020 年魏美才等系統(tǒng)回顧了中國葉蜂系統(tǒng)學(xué)和生物地理學(xué)研究歷史，給出了中國葉蜂種類名錄和研究文獻(xiàn)目錄。實(shí)驗(yàn)選取葉蜂成蟲胸部提取基因組DNA，殘骸繼續(xù)用酒精保存以做證據(jù)。 6 表 1 蕨 葉蜂 亞 科 與其它各亞科 系統(tǒng)發(fā)育研究選用類群信息 specimens information of Tenthredinidae researched in this study 所屬類群 基因序列號 采集地點(diǎn) 采集時間 科 亞 科 屬 種 名 Cytb 28SrDNA in group Tenthredinidae Selandriinae Aneugmenus Aneugmenus frontalis 0 0 湖北宜昌神農(nóng)架 Aneugmenus pteridii 0 0 湖南東安舜皇山 Neostromboceros Neostromboceros nipponicus 0 0 湖南東安舜皇山 Euforsius Euforsius pieli 0 0 湖南瀏陽大圍山 Allantinae Taxonus Taxonus attenatus 0 0 浙江臨安清涼峰 Linomorpha Linomorpha flava 0 0 浙江臨安清涼峰 Allantus Allantus nigrocaeruleus 0 0 湖南東安黃泥洞 Megabelesesinae Megabeleses Megabeleses liriodendrovorax 0 0 湖南瀏陽大圍山 Belesesinae Abeleses Abeleses rufotibialis 0 0 湖南東安舜皇山 Beleses Beleses nigroapicalis 0 0 湖南瀏陽大圍山 out group Blasticotomidae Runaria Runaria Runaria reducta EF032212 GQ374688 注 : “0”表示本次 實(shí) 驗(yàn)所得序列 , “no”表示序列缺失 , 有序列號標(biāo)注的為 NCBI 中下載的序列 . 7 實(shí)驗(yàn)用品 主要儀器 PCR 擴(kuò)增儀： 2720 Thermal Cycler，凝膠成像儀： TANON—2500R, 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀： DYY—8C，長沙平凡儀器儀表有限公司，臺式高速離心機(jī)： TG16W，移液槍： Eppendorf，數(shù)顯 恒溫水浴鍋： HH—S26，實(shí)驗(yàn)室超純水器： P105—W，多功能漩渦混合儀： 230/240VAC。 TBE緩沖液（ 5儲存液）：每升含 54g Tris堿， ， 20ml （ ）。 3 解剖葉峰，取個體胸部肌肉組織，于 離心管中液氮研磨；待液氮完 8 全揮發(fā)，加入 600ul 2% CTAB Buffer（已預(yù)熱）。 6 從水浴鍋中取出溶液，于 4℃ 7000rpm 下離心 3min，取上清液，去雜質(zhì)碎片。 10 用 4℃ 200ul 75%酒精洗滌沉淀 10000rpm下離心 3min，棄上清；重復(fù)一次。 （ 2） PCR 反應(yīng)循環(huán)體系及參數(shù) PCR 反應(yīng)體系 1 為 50ul 體系，成分如下： 28S DNA 基因的 PCR 反應(yīng)的參 數(shù)： 94℃預(yù)變性 1 分鐘， 33 個循環(huán)（ 94℃變 濃度 體積 ddH2O Primer Buffer 5ul Mix dNTP 4ul Primer1 10ul/mol 2ul Primer2 10ul/mol 2ul Template 2ul Taq DNA polymer 酶 9 性 30 秒， 55℃退火 30 秒， 72℃延伸 60 秒）；最后 72℃延伸 10 分鐘。 (2) ClustalX [30] ClustalX 是一個使用最廣泛的菜單操作的多序列比對程序，在任何主流的計算機(jī)平臺上都可以免費(fèi)使用 [31]。 截至目前， PAUP 是應(yīng)用最廣泛的系統(tǒng)發(fā)育分析軟件。然后用 ClustalX 進(jìn)行計算比對，再用 Mega 統(tǒng)計 28S DNA 基因序列堿基組成，計算遺傳距離。 11 圖 1所測樣品 PCR檢測結(jié)果 1 M 1 2 3 4 注： M： Marker： 200bpDNA，從下往上依次是 200bp， 400bp， 600bp， 800bp，1000bp,1200bp......圖中， 1： Arge xanthogaster； 2： Arge vulnerata； 3： Arge lingulopygia； 4： Eutomostethus formosanus。 28S rRNA 基因序列的長度和堿基組 成見表 2： 表 2 28S rRNA基因片段長度以及堿基組成 Species T(U) C A G Total 55 Euforsius pieli 28S 87 Aneugmenus frontalis 28S 173 Aneugmenus pteridii 175Neostrombceros nipponicus 91 Megabeleses liriodendrovorax 58Taxonus attenatus 28S 63 Linomorpha flava 28S 153 Allantus nigrocaeruleus 178 Abeleses rufotibialis 219 Beleses nigroapicalic Runaria reductadownload Avg. 1095 1082 1061 1069 1072 1029 1091 1113 1117 1081 1220 由表 2 統(tǒng)計結(jié)果可知 28S rRNA 平均堿基組成為： T： %； C： %； A： %；G： %，堿基組成沒有明顯 T\A 的偏好。采用 NJ、 ME 和 MP 法建分子系統(tǒng)樹分析它們在分子水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果表明：各亞科內(nèi)均獨(dú)立形成一支，成為單系群。分子數(shù)據(jù)有極強(qiáng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，是客觀、真實(shí)、可量化的，利用分子數(shù)據(jù)可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)上的不足。葉蜂總科中 6 個科的演化關(guān)系復(fù)雜。從論文的選題、實(shí)驗(yàn)操作、研究方法、結(jié)果分析、直至論文的審定都飽含著她眾多的辛勞。 最后，深深感謝在工作和求學(xué)之路上，所有關(guān)心和幫助過我的人。A（萬kWh）shg1Pshg1PshfPb b39。 6a*CZ7H$dq8Kqqf HVZFedswSyXTyamp。 qYpEh5pDx2zVkumamp。 qYpEh5pDx2zVkum amp。 qYpEh5pDx2zVkum amp。 qYpEh5pDx2zVkumamp。 qYpEh5pDx2zVkumamp。 qYpEh5pDx2zVkumamp。 qYpEh5pDx2zVkumamp。 qYpEh5pDx2 zVkum amp。 QA9wkxFyeQ^! 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