真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略(已修改)
2025-02-28 04:33 本頁(yè)面
【正文】 微生物基因工程 李剛 副教授 教學(xué)內(nèi)容 ? 一、 PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧； 二、基因組文庫(kù)的建立與篩選； 三、定向進(jìn)化技術(shù)在微生物酶制劑研究中 ? 的應(yīng)用； 四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略； ? 五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。 五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略 真核生物表達(dá)系統(tǒng)主要包括： 酵母表達(dá)系統(tǒng) 、 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 、 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng) 、 杜氏鹽藻生物反應(yīng)器 等五種表達(dá)系統(tǒng) 。 其中應(yīng)用最廣泛的是 酵母表達(dá)系統(tǒng) 。 真核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) ? 真核表達(dá)系統(tǒng)具有 翻譯后的加工修飾體系 ,表達(dá)的外源蛋白 更接近于天然蛋白質(zhì) 。 酵母表達(dá)系統(tǒng) ? 主要包括釀酒酵母 、 裂殖酵母 、 克魯維酵母 、甲醇酵母等表達(dá)系統(tǒng) 。 其中甲醇酵母基因表達(dá)系統(tǒng)是一種最近發(fā)展迅速的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng) ， 也是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng) 。 主要有 H. polymorpha、 Candida Bodinii、Pichia Pastoris三種 , 其中 Pichia Pastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)使用得最多 、 最廣泛 。 由于它具有無(wú)可匹敵的高表達(dá)特性 ,已被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的 真核表達(dá)系統(tǒng) 之一 。 酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) ? ① 酵母長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用于釀酒和食品工業(yè) , 不會(huì)產(chǎn)生毒素 , 安全可靠 。 ② 酵母是真核生物 , 能進(jìn)行一些表達(dá)產(chǎn)物的加工 , 有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性 。 ③ 外源基因在酵母中能 分泌表達(dá) ,表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外不僅有利于純化 , 而且避免了產(chǎn)物在胞內(nèi)大量蓄積對(duì)細(xì)胞的不利影響 。 ④ 遺傳背景清楚 , 容易進(jìn)行遺傳操作 。 ⑤ 較為 完善的表達(dá)控制系統(tǒng) , 如 PMA1 和 PDR5 等強(qiáng)啟動(dòng)子可以介導(dǎo)目的蛋白高水平表達(dá) , 表達(dá)蛋白的豐度可以達(dá)到膜蛋白的 10%。 酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn) ? 此外 , 采用誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子可以在時(shí)間上嚴(yán)格控制目的蛋白的表達(dá) , 如 GAL1 10( 半乳糖誘導(dǎo) ) 、PH05( 胞外無(wú)機(jī)磷誘導(dǎo) ) 和 HSE( 37℃ 溫度誘導(dǎo) ) 。 ⑥生長(zhǎng)繁殖迅速 , 培養(yǎng)周期短 , 工藝簡(jiǎn)單 , 生產(chǎn)成本低 。 ? 酵母菌用于真核基因的表達(dá)、分析 , 既具有原核表達(dá)系統(tǒng)生長(zhǎng)迅速、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn) , 又具有類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后修飾過(guò)程 , 因而特別適用于大量生產(chǎn)真核重組蛋白 , 正是由于有這些優(yōu)點(diǎn) , 使酵母功能基因組的研究得以走在生物功能基因組研究的前列 , 是應(yīng)用最為普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) ? 昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外十分推崇的真核表達(dá)系統(tǒng) 。 利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建的表達(dá)載體 ,可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表達(dá) 。 它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能 ,如二硫鍵的形成 、 糖基化及磷酸化等 ,使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白 。其最高表達(dá)量可達(dá)昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白總量的 50%。可表達(dá)非常大的外源性基因 (～ 200kD)。具有在同一個(gè)感染昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的能力 。對(duì)脊椎動(dòng)物是安全的 。 由于病毒多角體蛋白在病毒總蛋白中的含量非常高 ,至今已有很多外源基因在此蛋白的強(qiáng)大啟動(dòng)子作用下獲得高效表達(dá) 。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) ? 與其他的真核表達(dá)體系相比 ,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白 ,但 成本較高 。近年來(lái) ,研究者們主要通過(guò)改造宿主細(xì)胞和基因?qū)敕椒▉?lái)提高外源蛋白的表達(dá)效率。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常用的宿主細(xì)胞有 CHO、 COS、 BHK、SP2 /0、 N IH3T3等。將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞內(nèi)的方法 ,主要有化學(xué)法、電穿孔法、基因槍法和哺乳動(dòng)物病毒載體系統(tǒng) 等。 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng) ? 轉(zhuǎn)基因植物是指利用一定的手段將外源性或內(nèi)源性的基因?qū)氲街参矬w內(nèi)
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