真核表達系統(tǒng)的選擇和高效表達策略(編輯修改稿)
2025-03-10 04:33 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 CZA、 pPICZAB和 pPICZAC等； 分泌表達的載體有 pPIC pPIC9K、 pACO81 pPICZαA（ B、 C）和 pHILS1等 。 通用的整合載體多含有 AOX1啟動子 ， 有一個外源基因表達框 、 多克隆位點 （ MCS） 和一個從 AOX1基因上拷貝下來的終止序列 （ TT） ， 作為篩選標(biāo)記的 his4 基因和在細菌中進行復(fù)制起始點和選擇標(biāo)記 （ 如 ColE1復(fù)制起始點和抗氨芐青霉素基因 ） 以及 AOX13’端的非編碼區(qū)序列 ，使外源基因能以同源重組的方式整合到染色體的 AOX1部位 。 巴斯德畢赤酵母表達載體的結(jié)構(gòu)與功能 畢赤酵母表達載體的啟動子 ? Pichia pastoris 含有兩個基因編碼醇氧化酶 :AOX1和 AOX2 ,二者序列有 92 %同源性 ,但是 AOX1表達水平高于 AOX2。AOX1 啟動子的表達受甲醇嚴(yán)格調(diào)控。 以甲醇為碳源生長時 ,約 5%的 mRNA由 AOX1 基因轉(zhuǎn)錄。 PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子 ) 是最近在畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子 ,GAP 啟動子不需甲醇誘導(dǎo) ,發(fā)酵工藝更為簡單 .。Vassilen 利用 GAP 啟動子表達乙肝表面抗原獲 ? 得高表達 , Genzyme 也利用 GAP 啟動子表達人幾丁質(zhì)酶 ,不僅獲得高表達 ,而且還可以避免蛋白酶水解。 此外，Phongdara 在 Hansenul apolymorpha克隆到酸性磷酸酶 (p HO1) 基因啟動子 ，這些啟動子豐富了甲醇酵母對啟動子的選擇。 畢赤酵母表達載體上的選擇標(biāo)記 ? 選擇標(biāo)記一般為對應(yīng)于營養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因 , 常用 his4 , 也可用來源于釀酒酵母的 arg4基因和 suc2基因 . kanr基因和Shbler 基因（ Zeocin抗性基因）也能夠作為細菌和酵母菌的選擇標(biāo)記，并且攜帶這兩個標(biāo)記的表達載體較其他表達載體更易于篩選。 信號肽序列 ? 可供畢赤酵母選擇的信號肽有外源蛋白自身的信號肽和酵母本身的信號肽 . 有些蛋白的自身信號肽不能被畢赤酵母有效利用 ,可試用甲醇酵母信號肽。 目前可供選擇的酵母信號肽有 ?2交配因子的前導(dǎo)肽序列、酸性磷酸酶信號肽和蔗糖酶信號肽等 。 其中釀酒酵母 ? 2交配因子前導(dǎo)肽序列的使用最為廣泛。 酶切割位點周圍氨基酸序列及外源蛋白的 3 級結(jié)構(gòu)可以影響信號肽的加工效率。 畢赤酵母表達載體的種類 ? Invitrogen 公司開發(fā)出了若干系列的表達載體可供選擇。當(dāng)前常用的巴斯德畢赤酵母表達載體可分為 2 類 . ① 胞內(nèi)表達載體。如 pHIL2D2 ,pAO815 ,p PIC3 K,PICZ , pHWO10 , ? pGAPZ. ② 分泌表達載體。如 p HIL2S1 ,p PIC9 K,p PICZα,p GAPZα。 ? 目前主要采用酵母內(nèi)源性的信號肽來引導(dǎo)外源基因表達產(chǎn)物的分泌 , 常用 α2 因子信號肽。許多蛋白的正確構(gòu)象和翻譯后加工 (如糖基化等 ) 都是在分泌途中完成的。 外源基因的轉(zhuǎn)化及整合 ? 將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母中誘導(dǎo)表達， 其常用的轉(zhuǎn)化方法是電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體法 ,其中電轉(zhuǎn)化法最為方便 ,轉(zhuǎn)化效率最高 ,最容易產(chǎn)生多拷貝整合 . Zeocin 抑制細胞壁的形成 ,因此 pPICZ 系列不能使用原生質(zhì)體法進行轉(zhuǎn)化。 轉(zhuǎn)化時 ,載體 DNA 必須切成線狀才能與染色體進行同源重組 ,將整個載體連同外源基因整入宿主染色體 . 通常有以下幾種整合方式 : ① 雙位點互換。發(fā)生在染色體 AOX1 位點和表達質(zhì)粒中的 PAOX1及轉(zhuǎn)錄終止區(qū) ,產(chǎn)生的表達菌的表型為 His+Mut。② AOX1單位點互換。發(fā)生在染色體和表達質(zhì)粒的 AOX1 區(qū)。產(chǎn)生的表型是 His+Mut+。 ③ His 單位點置換。發(fā)生在染色體 His 位點和表達質(zhì)粒的 His 位點 ,使得 1 個或多個表達單位插入在 His 位點 ,產(chǎn)生的表型也是His+Mut+。巴斯德畢赤酵母載體在宿主染色體上大多為單拷貝整合 ,由于 PAOX1 的強啟動性和整合后的穩(wěn)定性
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