真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略-文庫吧
2025-02-10 04:33 本頁面
【正文】 ,使植物的遺傳性狀改變而產(chǎn)生的植物體。 轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器已在藥物蛋白的生產(chǎn)中被廣泛使用 ,成功表達(dá)的藥用蛋白質(zhì)和多肽有 :人的細(xì)胞因子、表皮生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長(zhǎng)激素、單克隆抗體等 . 煙草、馬鈴薯、大豆、香蕉、萵苣、羽扇豆等作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)口服疫苗 ,也得到了人們的廣泛關(guān)注。 轉(zhuǎn)基因植物疫苗和藥用蛋白的表達(dá)系統(tǒng)主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、植物病毒瞬時(shí)高效表達(dá)載體和植物葉綠體高效表達(dá)系統(tǒng)。 在研究成功的轉(zhuǎn)基因植物藥用蛋白中 , 80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)形成的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)。 ? 在重組藥物的多種表達(dá)體系中 ,轉(zhuǎn)基因植物是最經(jīng)濟(jì)的 。同一種重組蛋白在植物中的生產(chǎn)成本是微生物發(fā)酵體系的 2% 10% ,是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的 %。 杜氏鹽藻生物反應(yīng)器 ? 杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類 ,沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)外僅有一層糖蛋白和神經(jīng)氨酸組成的外膜，具有一個(gè)杯狀、大型的葉綠體 ,體積約占細(xì)胞的一半。 鹽藻是極其耐鹽的，可以在 0. 05 5 mol/ l氯化鈉的極端環(huán)境中生存。鹽藻屬于光和自養(yǎng)生物 ,能利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，富含 β胡蘿卜素、甘油、蛋白質(zhì)等。 鹽藻作為新型的真核生物反應(yīng)器，除了具有轉(zhuǎn)錄和翻譯后的加工能力外，還具有經(jīng)濟(jì)廉價(jià)、簡(jiǎn)單有效、安全可靠等特點(diǎn) 。由于它能在高鹽條件下培養(yǎng)，所以不會(huì)污染其他的微生物，這點(diǎn)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞所不及的。 外源基因在鹽藻中的表達(dá)主要是集中在 cat、 bar、 gus和 egfp等報(bào)告基因上 ,大多為瞬時(shí)表達(dá)。 目前 ,只有乙肝表面抗原 (HbsAg)和篩選標(biāo)記 bar基因能夠在鹽藻中穩(wěn)定表達(dá)。 鹽藻作為一種新型的生物反應(yīng)器 ,目前還不能真正生產(chǎn)外源性物質(zhì)。 研究者們正從強(qiáng)啟動(dòng)子的篩選、高效轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建、最佳轉(zhuǎn)化方法的確立等幾方面努力，目前已經(jīng)取得了一定的成果。 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) ? 畢赤酵母能夠成功表達(dá)出多種外源蛋白 ,是由于畢赤酵母具有以下獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn) : ? (1) 能夠快速繁殖和進(jìn)行高密度培養(yǎng) 。 ? (2) 具有強(qiáng)啟動(dòng)子 乙醇氧化酶 (AOX1)基因啟動(dòng)子 ,并且能 ? 夠嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá) 。 ? (3) 可以對(duì)外源蛋白進(jìn)行類似真核的加工折疊和翻譯后修 ? 飾 ,產(chǎn)物從而具有天然蛋白的活性 。 ? (4) 表達(dá)產(chǎn)量高 ,雜蛋白少 ,并且能夠胞外分泌表達(dá) ,容易分 ? 離提純 。 ? (5) 培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單 ,成本低。 ? 畢赤酵母與最早研究的釀酒酵母相比 ,能夠高密度培養(yǎng) ,容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化 ,并且不存在釀酒酵母的過度糖基化問題 ,也不易產(chǎn)生免疫原性問題。 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) ? 巴斯德畢赤酵母菌株： ? 一 般 用 于 外 源 基 因 表 達(dá) 的 Pichia pastoris 菌株有Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X33， KM71 , SMD1168等 . 根據(jù)利用甲醇的能力 , 可將巴斯德畢赤酵母分為 3 型 : ① Mut + 型為甲醇快利用型 , 此型畢赤酵母具有完整的 AOX1 和 AOX2 基因 , 絕大多數(shù)畢赤酵母為 Mut + 表型 。 ② Muts 型 ,此型畢赤酵母菌 (如 KM71) 細(xì)胞 AOX2 基因編碼的醇氧化酶可產(chǎn)生15%AOX活性 ,為甲醇慢利用型 。 ③ Mut型 (如 M2G10023) , 此型畢赤酵母 AOX1 及 AOX2 基因均被敲除 ,為甲醇不利用型 。研究發(fā)現(xiàn) , 蛋白酶缺陷型畢赤酵母 , 如 SMD1163,SMD1165 和 SMD1168 可有效降低外源目的蛋白的酶解 。 一般說來 ,蛋白胞內(nèi)表達(dá)時(shí) ,優(yōu)先考慮用 Muts 表型 ,對(duì)于分泌表達(dá) ,Mut+和 Muts都可使用 。 甲醇慢利用型有時(shí)比 Mut+ 型菌株能夠達(dá)到更高的表達(dá)量 。 Pichia pastoris表達(dá)載體 ? 畢赤酵母表達(dá)載體包括自我復(fù)制型的游離載體和整合型載體 ， 但以整合型載體為主 。 常見的整合載體又分為胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá) 2類 。 胞內(nèi)表達(dá)的載體有 pPIC pPIC3K、 pHILD pPI
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1