【正文】 第六講 原核基因表達(dá)調(diào)控 ? 緒論 ? 一、 乳糖操縱子的調(diào)控模式 ? 二、 色氨酸操縱子的調(diào)控模式 ? 三、 其他操縱子的調(diào)控機制 ? 四、 原核生物種的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 緒論 ? 原核生物和單細(xì)胞真核生物直接暴露在變幻莫測的環(huán)境中，食物供應(yīng)毫無保障，只有能根據(jù)環(huán)境條件的改變合成各種不同的蛋白質(zhì)，使代謝過程適應(yīng)環(huán)境的變化，才能維持自身的生存和繁衍。自然選擇傾向于保留高效率的生命過程。在一個每 30min增殖一倍的 109細(xì)菌群體中，若有一個細(xì)菌變成了，大約經(jīng)過 80天的連續(xù)生長后，這個群體中的 %都將具有 長速度。 ? 一個大腸桿菌細(xì)胞中約有 25003000個基因。估計正常情況下，可帶有 107個蛋白質(zhì)，平均每個基因產(chǎn)生 3000多個蛋白質(zhì)分子。但大腸桿菌中一般帶有 15,00030,000個核糖體，有 50余種核糖體結(jié)合蛋白，數(shù)量也很驚人。此外，負(fù)責(zé)糖酵解系統(tǒng)的蛋白質(zhì)數(shù)量也很大。而象半乳糖苷酶等誘導(dǎo)酶，其含量可少至每細(xì)胞僅 15個分子。 ? 一個體系在需要時被打開，不需要時被關(guān)閉。這種 “開 關(guān) ”（ onoff）活性是通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄來建立的，也就是說 mRNA的合成是可以被調(diào)節(jié)的。當(dāng)我們說一個系統(tǒng)處于 “off”狀態(tài)時，也有本底水平的基因表達(dá)，常常是每世代每個細(xì)胞只合成 1或 2個mRNA分子。所謂 “關(guān) ”實際的意思是基因表達(dá)量特別低，很難甚至無法檢測。 ? 科學(xué)家把這個從 DNA到蛋白質(zhì)的過程稱為基因表達(dá) (gene expression)，對這個過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達(dá)調(diào)控 (gene regulation或 gene control)。要了解動、植物生長發(fā)育的規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，就必須弄清楚基因表達(dá)調(diào)控的時間和空間概念，掌握了基因表達(dá)調(diào)控的秘密，我們手中就有了一把揭示生物學(xué)奧妙的金鑰匙。 ? 基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在以下幾個方面： ① 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控 (transcriptional regulation)； ② mRNA加工成熟水平上的調(diào)控 (differential processing of RNA transcript)； ③ 翻譯水平上的調(diào)控 (differential translation of mRNA). ? 原核生物中，營養(yǎng)狀況 (nutritionalstatus)和環(huán)境因素 (environmental factor)對基因表達(dá)起著舉足輕重的影響。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平 (hormone level)和發(fā)育階段(developmental stage)是基因表達(dá)調(diào)控的最主要手段，營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響力大為下降。 一、 乳糖操縱子的調(diào)控模式 ? 大腸桿菌乳糖操縱子 (lactose operon)包括 3個結(jié)構(gòu)基因： Z、 Y和 A，以及啟動子、控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄時， RNA聚合酶首先與啟動區(qū) (promoter,P)結(jié)合，通過操縱區(qū)(operator,O)向右轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄從 O區(qū)的中間開始，按 Z→Y→A 方向進(jìn)行，每次轉(zhuǎn)錄出來的一條 mRNA上都帶有這 3個基因。轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是啟動區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的 . ? Z編碼 β半乳糖苷酶； Y編碼 β半乳糖苷透過酶；A編碼 β半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶。 β半乳糖苷酶是一種 β半乳糖苷鍵的專一性酶，除能將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，還能水解其他 β半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。 β半乳糖苷透過酶的作用是使外界的 β半乳糖苷（如乳糖）能透過大腸桿菌細(xì)胞壁和原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 β半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶的作用是把乙酰輔酶 A上的乙?；D(zhuǎn)到 β半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。 ? 1． 酶的誘導(dǎo) lac體系受調(diào)控的證據(jù)在不含乳糖及 β半乳糖苷的培養(yǎng)基中， lac+基因型每個大腸桿功細(xì)胞內(nèi)大約只有 12個酶分子。如果在培養(yǎng)基中加入乳糖，酶的濃度很快達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的 6%或 7%，每個細(xì)胞中可有超過 105個酶分子。 ? 科學(xué)家把大腸桿菌細(xì)胞放在加有放射性 35S標(biāo)記的氨基酸但沒有任何半乳糖誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中繁殖幾代，然后再將這些帶有放射活性的細(xì)菌轉(zhuǎn)移到不含 35S、無放射性的培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的加入， β半乳糖苷酶便開始合成。分離 β半乳糖苷酶，發(fā)現(xiàn)這種酶無 35S標(biāo)記。說明酶的合成不是由前體轉(zhuǎn)化而來的，而是加入誘導(dǎo)物后新合成的。 ? 已經(jīng)分離在有誘導(dǎo)物或沒有誘導(dǎo)物的情況下都能產(chǎn)生 lacmRNA的突變體，這種失去調(diào)節(jié)能力的突變體稱為永久型突變體，為分兩類： I型和 O型。 I型：野生型為 I+，突變型為 I O型：野生型為 O+，突變型為 Oc。 ? I+→I 或 O+→Oc 后， Z、 Y、 A結(jié)構(gòu)基因均表現(xiàn)為永久表達(dá)，所以 I基因被稱為調(diào)節(jié)基因 (regulatory gene)。研究發(fā)現(xiàn)， I基因是一個產(chǎn)生阻遏物的調(diào)節(jié)基因，其產(chǎn)物使體系關(guān)閉。 I突變體由于不能產(chǎn)生阻遏物，使細(xì)胞成為 lac永久表達(dá)型。 I/I+局部二倍體由于帶有一個正常阻遏物，使細(xì)胞中的 lac仍然被抑制。 ? 遺傳學(xué)圖譜分析指出， Oc突變位于 I與 Z之間，所以， lac體系的 4個基因的序列為IOZY。通過這些觀察， Jacob和 Monod推斷 Oc突變代表 DNA鏈上的一個位點或一個非編碼區(qū)域，而不是一個基因，因為可編碼的基因具有互補性，而 Oc沒有這一特性。O決定相鄰 Z基因的產(chǎn)物是誘導(dǎo)型合成還是永久型合成， O區(qū)域稱為操縱基因。 2. 操縱子模型 Jacob和 Monod認(rèn)為誘導(dǎo)酶（他們當(dāng)時稱為適應(yīng)酶）現(xiàn)象是個基因調(diào)控問題，可以用實驗方法進(jìn)行研究，因此選為突破口，終于通過大量實驗及分析，建立了該操縱子的控制模型。 ① Z、 Y、 A基因的產(chǎn)物由同一條多順反子的 mRNA分子所編碼。 ② 這個 mRNA分子的啟動子緊接著 O區(qū)，而位于 I與O之間的啟動子區(qū)（ P），不能單獨起動合成 β半乳糖苷酶和透過酶的生理過程。 ③ 操縱基因是 DNA上的一小段序列（僅為 26bp），是阻遏物的結(jié)合位點。 ④ 當(dāng)阻遏物與操縱基因結(jié)合時， lacmRNA的轉(zhuǎn)錄起始受到抑制。 ⑤ 誘導(dǎo)物通過與阻遏物結(jié)合，改變它的三維構(gòu)象，使之不能與操縱基因結(jié)合，從而激發(fā) lacmRNA的合成。當(dāng)有誘導(dǎo)物存在時，操縱基因區(qū)沒有被阻遏物占據(jù)，所以啟動子能夠順利起始 mRNA的合成。 3. Lac操縱子的本底水平表達(dá) ? 因為誘導(dǎo)物需要穿過細(xì)胞膜才能與阻遏物結(jié)合，而運轉(zhuǎn)誘導(dǎo)物需要透過酶。在非誘導(dǎo)狀態(tài)下有少量（ 15個 mRNA分子） lac mRNA合成 本底水平永久型合成。 4. 葡萄糖對 lac操縱子的影響 代謝物阻遏效應(yīng) 研究表明，葡萄糖對 lac操縱子表達(dá)的抑制作用是間接的，因為存在一種大腸桿菌突變株，它正常的糖酵解過程受阻，葡萄糖 6磷酸不能轉(zhuǎn)化為下一步代謝中間物，該菌株能在有葡萄糖存在的情況下被誘導(dǎo)合成lac mRNA。 5. cAMP與代謝物激活蛋白 ? 當(dāng)葡萄糖和乳糖同時存在于培養(yǎng)基中時，lac啟動子表達(dá)受阻，沒有 β半乳糖苷酶活性；當(dāng)葡萄糖消耗完以后（圖中箭頭處），細(xì)胞內(nèi) cAMP濃度增加， β半乳糖苷酶活性被誘導(dǎo)，一度停止生長的細(xì)胞又恢復(fù)分裂。如果將細(xì)菌放在缺乏碳源的培養(yǎng)基中，細(xì)胞內(nèi) cAMP濃度就很高；若在含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)菌中的 cAMP濃度就會很低；如果將細(xì)菌置于甘油或乳糖等不進(jìn)行糖酵解的碳源培養(yǎng)基中，細(xì)菌中 cAMP的濃度也會很高。 ? 研究證實，葡萄糖所引起的代謝物抑制(Catabolite repression)現(xiàn)象的實質(zhì)是該代謝物降低了細(xì)胞中 cAMP的含量 .事實上， cAMPCAP復(fù)合物是 lac體系的 positive regulator，它們不能代替 lacI和 lacO的功能 (negative regulator)。 ? cAMPCAP不但能與 DNA相結(jié)合，造成雙螺旋彎曲，易于形成三元轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，它還能直接影響 RNA聚合酶的活性。 Dominant negative（ Transdominant） lacId，只要有這個 環(huán) 的亞基存在， lacI+基因產(chǎn)物（阻遏物）無法與 O區(qū)相結(jié)合 lac operon得到表達(dá)。 6. lac操縱子 DNA的調(diào)控區(qū)域 lac P（啟動子區(qū)）從 I基因結(jié)束到mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點止，共長 82bp（ 82～+1） O區(qū)就是阻遏物結(jié)合區(qū)，位于 P區(qū)后半部分和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（ 7～ +28），該區(qū)序列有對稱性，其對稱中心點在 +11位。 P區(qū)的CAMPCAP結(jié)合區(qū)（ 67～ 52）也有對稱性，其對稱位點在 60～ 59之間。 在一個完全被誘導(dǎo)的細(xì)胞中， β半乳糖苷酶、透過酶及乙?；D(zhuǎn)移酶的拷貝數(shù)比例為 1::，這個比例在一定程度上反映了以 β半乳糖苷作為唯一碳源時細(xì)胞的需要。不同的酶在數(shù)量上的差異是由于在翻譯水平上受到調(diào)節(jié)所致。 ① lac mRNA可能與翻譯過程中的核糖體相脫離，從而終止蛋白質(zhì)鏈的翻譯。這種現(xiàn)象發(fā)生的頻率取決于每一個后續(xù)的 AUG密碼子再度起始翻譯的概率。 ② 在 lac mRNA分子內(nèi)部， A基因比 Z基因更易受內(nèi)切酶作用發(fā)生降解，因此，在任何時候 Z基因的完整拷貝數(shù)要比 A基因多。 二、 色氨酸操縱子的調(diào)控模式 ? 色氨酸操縱子 (tryptophane operon)負(fù)責(zé)色氨酸的生物合成，當(dāng)培養(yǎng)基中有足夠的色氨酸時，這個操縱子自動關(guān)閉，缺乏色氨酸時操縱子被打開， trp基因表達(dá)，色氨酸或與其代謝有關(guān)的某種物質(zhì)在阻遏過程（而不是誘導(dǎo)過程）中起作用。由于 trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或 cAMPCAP的調(diào)控。 ? 色氨酸的合成分 5步完成。每個環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這 5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉(zhuǎn)錄在一條多順反子 mRNA上，分別以 trpE、 trpD、 trpC、 trpB、trpA代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油 3磷酶合成酶。 ? trpE基因是第一個被翻譯的基因，和 trpL和 trpa（不是 trpA）。 trp操縱子中產(chǎn)生阻遏物的基因是 trpR，該基因距 trp基因簇很遠(yuǎn)，后者在大腸桿菌染色體圖上 25min處，而前者則位于 90min處。在位于 65min處還有一個 trpS（色氨酸 tRNA合成酶），它和攜帶有 trp的 tRNATrp也參與 trp操縱子的調(diào)控作用。 ? L區(qū)編碼了前導(dǎo)肽，當(dāng)有高濃度 Trp存在時，由于弱化子 a的作用，轉(zhuǎn)錄迅速減弱停止，生成 140核苷酸的前導(dǎo) RNA；當(dāng) Trp濃度較低時，弱化子不起作用，轉(zhuǎn)錄得以正常進(jìn)行，生成長約 7kb的 mRNA，操縱子中第一個結(jié)構(gòu)基因的起始密碼子 AUG在 +162處。 1． trp操縱子的阻遏系統(tǒng) ? trpR基因突變常引起 trp mRNA的永久型合成，該基因產(chǎn)物因此被稱為輔阻遏蛋白 (aporepressor)。除非培養(yǎng)基中有色氨酸，否則這個輔阻遏蛋白不會與操縱區(qū)結(jié)合。輔阻遏蛋白與色氨酸相結(jié)合形成有活性的阻遏物，與操縱區(qū)結(jié)合并使之關(guān)閉轉(zhuǎn)錄 trp mRNA。 ? 阻遏 操縱機制對色氨酸來說是一個一級開關(guān)，主管轉(zhuǎn)錄是否啟動，相當(dāng)于粗調(diào)開關(guān)。 trp操縱子中對應(yīng)于色氨酸生物合成的還有另一個系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)調(diào)控，指示已經(jīng)啟動的轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)下去。這個細(xì)微調(diào)控是通過轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一個結(jié)構(gòu)基因之前的過早終止來實現(xiàn)的，由色氨酸的濃度來調(diào)節(jié)這種過早終止的頻率。 2．弱化子與前導(dǎo)肽 ? 在 trp mRNA 539。端 trpE基因的起始密碼前有一個長162bp的 mRNA片段被稱為前導(dǎo)區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)mRNA合成起始以后，除非培養(yǎng)基中完全沒有色氨酸，轉(zhuǎn)錄總是在這個區(qū)域終止，產(chǎn)生一個僅有 140個核苷酸的 RNA分子，終止 trp基因轉(zhuǎn)錄。因為轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在這一區(qū)域，并且這種終止是被調(diào)節(jié)的，這個區(qū)域就被稱為弱化子。 ? 分析前導(dǎo)肽序列，發(fā)現(xiàn)它包括起始密碼子 AUG和終止密碼子 UGA，編碼了一個 14個氨基酸的多肽。該多肽有一個特征，其第 10位和 11位有相鄰的兩個色氨酸密碼子。正是這兩個相連的色氨酸密碼子（組氨酸、苯丙氨酸操縱子中都有這種現(xiàn)象）調(diào)控了蛋白質(zhì)的合成。 ? 當(dāng)培養(yǎng)基中色氨酸的濃度很低時，負(fù)載有色氨酸的tRNATrp也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢，當(dāng) 4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體才進(jìn)行到 1區(qū)（或停留在兩個相鄰的 trp密碼子處），這時的前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是 23配對，不形成 34配對的終止