第二十章-蛋白質(zhì)的復(fù)性(已修改)
2025-08-17 10:44 本頁面
【正文】 蛋白質(zhì)的復(fù)性 蛋白質(zhì)的復(fù)性 ? 為什么要進行蛋白質(zhì)的復(fù)性？ ? 外源基因?qū)?物（ r干擾素，白細(xì)胞介素 2，人生長激素等 ）時，相當(dāng)多的產(chǎn)物形成了包涵體，而沒有蛋白質(zhì)的活性。所以要進行蛋白質(zhì)的復(fù)性。 ? ？ ? （特別是 ）？ 蛋白質(zhì)復(fù)性 包含體（ inclusion body,IB）是外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時，尤其在大腸桿菌細(xì)胞 中高效表達(dá)時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為 高折射區(qū)，與細(xì)胞質(zhì)中的其他成分有明顯的區(qū)別。 蛋白質(zhì)復(fù)性 包含體形成的原因 包涵體的形成比較復(fù)雜，有些機理還不清楚； (1)表達(dá)量過高： 包含體的形成與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成速率有關(guān)，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)的聚集體； (2)包含體的形成還被認(rèn)為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、 pH值、離子強度、氧化還原電勢及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的功能等因素有關(guān)。 (3)大腸桿菌的生長過程在受到某些因素的影響時，其本身蛋白質(zhì)的表達(dá)也可出現(xiàn)異常，造成蛋白質(zhì)的聚集從而形成包含體。 蛋白質(zhì)復(fù)性 ? 包含體形成的原因 （ 4）重組蛋白的氨基酸組成 （ 5）重組蛋白時大腸桿菌的異源蛋白，缺乏一些蛋白折疊過程中所需要的酶和輔助因子。 （ 6）在細(xì)菌表達(dá)蛋白過程中，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。 蛋白質(zhì)復(fù)性 包含體的形成的優(yōu)勢 形成包含體對克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)具有保護作用，大腸桿菌可產(chǎn)生蛋白質(zhì)水解酶，可降解不穩(wěn)定的多肽，許多可溶性的重組蛋白質(zhì)對這些酶敏感，使得利用細(xì)菌作為表達(dá)宿主時受到限制，然而隔離在包含體內(nèi)的蛋白質(zhì)可免受蛋白酶的降解作用；此外對宿主菌有毒性的重組蛋白以無活性聚集體的形式存在也可以降低對宿主菌的毒害作用。 優(yōu)勢 : 包含體可避免被水解酶水解 蛋白質(zhì)復(fù)性 包含體的理化特性 ⑴大部分包含體不能滲透出細(xì)胞，需要人工進行細(xì)胞破碎來進行釋放產(chǎn)物。 ⑵大部分包含體在細(xì)胞內(nèi)凝聚成沒有活性的顆粒固體（ r干擾素，白細(xì)胞介素 2，人生長激素） 特點：包含體組成基本上由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部 分（占 50%以上）是基因工程產(chǎn)品，產(chǎn)物一級結(jié)構(gòu) 是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯誤的，沒有生物學(xué)活性 。 蛋白質(zhì)復(fù)性 基因表達(dá)系統(tǒng)一般分為真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng) 。 由于真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母 、 昆蟲細(xì)胞 、 哺乳動物細(xì)胞等產(chǎn)生的重組蛋白價格高 、 產(chǎn)量低 ， 而且操作復(fù)雜 、 產(chǎn)品周期長 ，而原核表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)成本低 、 生長快 、 表達(dá)量高 、 基因操作方便 ， 因此 ， 目前它們?nèi)允腔蚬こ痰闹饕磉_(dá)系統(tǒng) ，特別是大腸桿菌 。 ? 大腸桿菌的重組菌 有多種可選擇的質(zhì)粒； 重組遺傳背景清楚，基因表達(dá)易于控制； 蛋白表達(dá)量高（可達(dá)總蛋白 50％）； ? 但原核表達(dá)系統(tǒng)也有一個問題，很多外源蛋
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