【正文】 項目名稱：病毒與宿主細胞相互作用分子機制的研究首席科學(xué)家：于曉方 吉林大學(xué)起止年限：依托部門：教育部一、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究內(nèi)容本項目選擇重大傳染性疾病艾滋病的病原體人免疫缺陷病毒（HIV）為主要研究對象，在大量原創(chuàng)性前期工作基礎(chǔ)上，對病毒與宿主細胞相互作用的分子機制進行系統(tǒng)研究，以期揭示“病毒與宿主蛋白形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)在病毒侵染、復(fù)制、潛伏、出芽、耐藥性中的功能和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)”這一重要科學(xué)問題。圍繞上述科學(xué)問題，本項目：（1）將病毒學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)有機結(jié)合起來，在功能及作用機制基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究，解析一批重要病毒、宿主蛋白以及形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，解決本領(lǐng)域二十年來的科學(xué)熱點和難點，闡明病毒與宿主蛋白相互作用及其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的功能與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（課題1）；（2）以Tetherin等宿主天然防御因子為研究重點，利用蛋白組學(xué)和計算化學(xué)等技術(shù)手段，研究宿主天然防御因子的分子作用機制及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，解析病毒與宿主細胞相互作用在宿主抵御病毒感染中的生物學(xué)功能（課題3）；（3），以TSG101及ESCRT復(fù)合物為研究重點，研究宿主細胞內(nèi)參與病毒組裝釋放的核心環(huán)節(jié)，系統(tǒng)闡明病毒與宿主細胞相互作用在病毒復(fù)制中的生物學(xué)功能（課題4）；（4）從宿主遺傳多態(tài)性和病毒耐藥性兩個研究熱點入手，研究宿主因子與艾滋病易感性、病程進展及耐藥性的相關(guān)性，闡明病毒與宿主細胞相互作用在艾滋病的發(fā)生與發(fā)展的作用（課題2）；（5）應(yīng)用本課題組獨有的隨機基因敲除調(diào)控技術(shù)平臺，全基因組篩選HIV1感染潛伏期和重激活的關(guān)鍵宿主細胞因子，研究病毒與宿主細胞相互作用在病毒感染潛伏和重激活中的重要調(diào)控功能（課題4）。本課題緊密圍繞“病毒與宿主細胞相互作用”這一主題，以“功能與結(jié)構(gòu)學(xué)結(jié)合”為重點研究方向，從病原感染與宿主防御兩個視角，從分子水平的結(jié)構(gòu)生物學(xué)到整體水平的艾滋病發(fā)生發(fā)展的多層面，系統(tǒng)研究HIV1與宿主相互作用在病毒侵染、復(fù)制、潛伏、出芽、耐藥性中的功能和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為闡明其他病原體與宿主細胞相互作用機制的共同性和規(guī)律性提供理論基礎(chǔ)和研究系統(tǒng)與平臺，為提升我國重大傳染性疾病的防控、疫苗與藥物研發(fā)的整體水平奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容： 針對上述關(guān)鍵科學(xué)問題，擬開展以下研究：（一）系列HIV病毒蛋白與宿主蛋白相互作用及其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的分子作用機制。HIV1 Vif蛋白及其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的分子作用機制。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)了一個新的細胞內(nèi)調(diào)控因子VifF1（數(shù)據(jù)未發(fā)表），在Vif與CulElonginB、ElonginC等宿主蛋白形成的E3泛素化連接酶的功能中至關(guān)重要，而這一過程對病毒的復(fù)制至關(guān)重要。我們將進一步確定VifF1在HIV1 Vif蛋白形成的 E3泛素連接酶和逃避宿主防御因子APOBEC3蛋白過程中的具體作用機制，以及HIV1 Vif與新的調(diào)控因子VifF1的相互作用界面。HIV Vpr和Vpx蛋白的生物學(xué)功能和分子作用機制。Vpr和Vpx為艾滋病病毒的功能性基因，它們對病毒的復(fù)制、尤其在巨噬細胞中的復(fù)制至關(guān)重要。我們將考察Vpr蛋白中一些重要的功能區(qū)對其參與調(diào)節(jié)HIV1病毒逆轉(zhuǎn)錄過程的保真性，核運輸以及核定位，誘導(dǎo)的被侵染細胞的細胞周期阻滯等重要生理功能的影響；同時揭示 Vpr誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制；Vpr促進HIV1在巨噬細胞中感染的機制。2011年5月研究證明Vpx蛋白能夠抑制宿主細胞內(nèi)的抗病毒因子SAMHD1，而Vpx能夠與宿主蛋白DDBCul4A和DCAF1形成E3連接酶我們將進一步確定Vpx抑制SAMHD1的分子作用機制，Vpx的重要功能區(qū)。HIV1 Vpu蛋白及形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的分子機制。HIV的Vpu蛋白能夠拮抗和抑制病毒顆粒釋放的Tetherin蛋白，盡管目前有一些前期結(jié)果，但仍存在同研究結(jié)果之間仍具有矛盾的結(jié)論，將進一步的證實Vpu和Tetherin之間相互作用與拮抗機制，Vpu結(jié)合Tetherin后在細胞內(nèi)的運轉(zhuǎn)過程，以及Vpu介導(dǎo)的CD4和Tetherin降解途徑的關(guān)系。TSG101對HIV病毒出芽的抑制作用和機理。本項目將進一步研究TSG101在病毒出芽過程中的分子作用機制；HIV病毒在長期TSG101阻斷條件下的生物特性、突變譜和病毒出芽能力。特別是HIV Gag基因突變株對病毒出芽能力的作用和機理；TSG101與ESCRT復(fù)合物相互作用中對細胞生理活動的影響。（二）宿主天然防御因子的分子作用機制。宿主天然防御因子Tetherin的抗病毒作用機制。宿主細胞內(nèi)天然抗病毒因子Tetherin，作用于所有有膜病毒，不僅可以抑制HIV1等逆轉(zhuǎn)錄病毒，還可以抑制Lassa病毒、Marburg病毒和Ebola病毒等其他種類病毒的細胞釋放。HIV的Vpu蛋白對Tetherin具有抑制作用，我們將具體確定Tetherin在細胞膜病毒裝配和出芽過程中的作用，進一步揭示Tetherin降低病毒感染性的作用機制，Tetherin在病毒感染后影響pDC的功能中的作用。宿主天然防御因子SAMHD1的抗病毒作用機制。作為最近被定義的病毒Vpx蛋白抑制的宿主防御因子SAMHD1，目前對其所知甚少，我們將進一步考察SMAHD1的廣譜抗病毒作用，不同種屬SAMHD1的抗病毒作用，SAMHD1的抗病毒機制。宿主天然防御因子APOBEC3蛋白的抗病毒作用。繼續(xù)深入研究被HIV Vif蛋白所抑制的APOBEC3家族蛋白的抗病毒作用機制，A3G被包裝進病毒的機制。HIV1感染潛伏期和重激活的關(guān)鍵宿主細胞因子的分子作用機制。我們將深入研究關(guān)鍵宿主細胞因子調(diào)節(jié)HIV1前病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制；對HIV1蛋白合成和降解調(diào)控機制；對HIV1前病毒的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制；HIV1 蛋白與關(guān)鍵宿主細胞因子相互作用和功能結(jié)構(gòu)域；HIV1 蛋白與關(guān)鍵宿主細胞因子相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)；關(guān)鍵宿主細胞因子的淋巴細胞和巨噬細胞中的表達、調(diào)控和修飾等（三）鑒定影響HIV病毒生活周期新的關(guān)鍵的細胞因子。采用免疫共沉淀和改良的差減雜交等技術(shù)篩選和鑒定宿主細胞內(nèi)拮抗Vpr的抗病毒因子。鑒定病毒與抗病毒因子（Vpu/Tetherin）復(fù)合物中的新細胞因子。Tetherin自身也可以泛素化，并且TrCP在Vpu拮抗Tetherin的過程中只有部分作用，在這個過程中應(yīng)該還有另外的E3連接酶。蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以提供線索發(fā)現(xiàn)復(fù)合物中的新的細胞因子。全基因組篩選HIV1感染潛伏期和重激活的關(guān)鍵宿主細胞因子。（四）病毒蛋白及其形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。HIV1 Vif蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。VifF1因子對Vif的正確折疊具有輔助作用，圍繞HIV1 Vif，對其形成的含有CulElonginB、ElonginC或VifFA3G的蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物進行重點研究，在體外共表達蛋白質(zhì)復(fù)合物，并進行純化，結(jié)晶條件篩選，獲得蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu)，最終獲得Vif結(jié)構(gòu)方面的突破性研究，并在此基礎(chǔ)上闡述結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。 HIV Vpx蛋白及其蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。體外單獨或共表達Vpx及其形成的含有DCAF1或DDB1的蛋白質(zhì)復(fù)合物，純化，結(jié)晶條件篩選，獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)并解析。Tetherin蛋白及形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究。Vpu和Tetherin之間通過它們的TM區(qū)相互作用，通過NMR深入研究Tetherin的TM區(qū)結(jié)構(gòu)，以及兩者TM區(qū)結(jié)合復(fù)合物。A3G蛋白及形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)研究。通過分子作用機制研究確定A3G特異性結(jié)合的RNA，有助于我們在體外表達體系中加入此共因子以輔助A3G N端蛋白的正確折疊和可溶性表達，以便于在體外條件下進行結(jié)晶條件篩選、優(yōu)化，最終獲得A3G N端蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析。（五）宿主因子在艾滋病易感性、病程進展及耐藥性發(fā)生中的作用。1. 研究宿主因子遺傳多態(tài)性與艾滋病毒感染、發(fā)病及疾病進展中的相關(guān)性。研究APOBEC3超家族成員、Tetherin、TSG101等關(guān)鍵宿主因子在艾滋病毒感染者和艾滋病人中，特別是暴露未感者和長期非進展者中的表達水平和基因變異，確定其遺傳多態(tài)性和艾滋病毒感染、發(fā)病及疾病進展的相關(guān)性及其分子機制，探索以宿主因子遺傳多態(tài)性為分子標(biāo)志物預(yù)測HIV1易感人群和病程進展的可行性。2. APOBEC3超家族成員在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組變異和耐藥性形成中的作用。研究不同物種來源的APOBEC3超家族成員在其相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒中引入非致死性突變的能力，對病毒基因組突變頻率的影響；闡明APOBEC3超家族成員的非致死性突變能力與HIV1耐藥性形成的相關(guān)性，為探索通過抑制APOBEC3超家族成員的非致死性突變能力降低病毒變異和耐藥性發(fā)生頻率的新防治策略奠定理論基礎(chǔ)。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)