【正文】 1 基因治療 Gene therapy 2 ? （一）、基因治療的發(fā)展簡(jiǎn)史、概念及背景 ? （二）、基因治療的基因?qū)胂到y(tǒng) ? （三）、基因治療的途徑 ? （四）、基因治療的靶細(xì)胞研究 ? （五）、基因治療在單基因遺傳病、腫瘤和心血管疾病治療上的應(yīng)用 ? （六）、基因治療面臨的問題和挑戰(zhàn) ? （七）、基因治療的發(fā)展方向 3 （一）、基因治療的發(fā)展簡(jiǎn)史、 概念及背景 4 基因治療的發(fā)展簡(jiǎn)史 時(shí)間 發(fā)生事件 研究者 1944 DNA是轉(zhuǎn)化物質(zhì) Avery 1953 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型 Watson and Crick 1963 遺傳密碼的破譯 Brenner 1979 重組體 DNA技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染 Mulligan and Berg 1980 臨床地貧研究 Cline 1990 第一個(gè)臨床試驗(yàn)（ ADA)基因 Blas233。 and Anderson 1992 大量癌癥臨床試驗(yàn) 美國(guó)等 1993 中國(guó)制定第一部基因治療質(zhì)控要點(diǎn) 中國(guó) 1997至今 重組病毒的產(chǎn)業(yè)化及其技術(shù)改進(jìn) 美國(guó) 5 基因治療的概念 ? 經(jīng)典： 針對(duì)遺傳病某一基因缺陷，將外源基因?qū)塍w內(nèi)予以矯正； ? 現(xiàn)在： 凡是在基因水平上進(jìn)行操作而達(dá)到治療疾病的所有療法 6 ? 上世紀(jì)九十年代初，一位因 ADA(腺苷酸脫氨酶 )基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院用 ADA基因治療，取得療效?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜?，起而效顰，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景。 7 8 截止到 2022年 1月，基因治療試驗(yàn)的全球分布： 9 截止到 2022年 1月，基因治療試驗(yàn)的國(guó)家分布： 10 基因治療的疾病類型： 11 基因治療試驗(yàn)的臨床階段： 12 1989 2022年 1月，每年全球被批準(zhǔn)的臨床數(shù)目： 13 基因治療選用的載體分類 14 世界第一個(gè)基因治療藥物在中國(guó)誕生 ? 人民網(wǎng)深圳 2022年 10月 22日 15： 30急電 正在這里召開的深圳市政府新聞發(fā)布會(huì)向世界公布了一項(xiàng)振奮人心的消息：“世界首個(gè)基因治療藥物在中國(guó)誕生”。 ? 深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制開發(fā)的抗癌新藥 ——“重組人 p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”）， 10月 16日獲得國(guó)家儀器藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。這標(biāo)志著我國(guó)在基因治療藥物研制和產(chǎn)業(yè)化方面已達(dá)世界領(lǐng)先水平，在國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中搶占了先機(jī)。 ? 賽百諾公司負(fù)責(zé)人說，這種新藥是擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的廣譜腫瘤基因治療藥品，可望明年一月正式上市。 15 ? 根據(jù)靶細(xì)胞的類型分類： 生殖細(xì)胞（ germ cell)基因治療： 體細(xì)胞（ somatic cell)基因治療 ? 根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑分類： in vivo(活體直接轉(zhuǎn)移或稱一步法） ex vivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法） 基因治療的種類 16 ? 基因置換 ? 基因置換就是用正常的基因原位置換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的突變致病基因完全恢復(fù)正常狀態(tài)，這種基因治療方法最為理想。但這種方法是建立在同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上的，而目前同源重組雖然在技術(shù)上可行，但重組的效率很低，遠(yuǎn)沒達(dá)到基因治療要求的水平，在臨床試驗(yàn)上就更無法實(shí)現(xiàn)了。 基因治療的策略 17 ? 基因修復(fù) ? 基因修復(fù)是指將致病基因的突變堿基序列定點(diǎn)糾正，可用來治療點(diǎn)突變導(dǎo)致的疾病。但由于糾錯(cuò)效率低的原因，實(shí)踐中有相當(dāng)?shù)碾y度。 18 ? 基因增補(bǔ) ? 將目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，其表達(dá)產(chǎn)物能補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能，可用于隱性遺傳病的治療。 19 ? 基因失活 ? 利用反義技術(shù)特異性封閉、抑制有害基因表達(dá)，可用于一些顯性遺傳病或腫瘤的基因治療。 20 ? Andrew Z. Fire、 Craig C. Mello 21 ? 1998年 Andrew Z. Fire、 Craig C. Mello等發(fā)現(xiàn)將很少量的雙鏈 RNA注入秀麗線蟲體內(nèi)，即可高效、特異地阻斷 /抑制與雙鏈 RNA同源的基因表達(dá)，其阻斷 /抑制率比純化后的反義 RNA技術(shù)高若干個(gè)數(shù)量級(jí)。雙鏈 RNA導(dǎo)入細(xì)胞后引起與該段RNA同源的 mRNA發(fā)生特異性降解，進(jìn)而使相應(yīng)基因抑制的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象稱 RNA干擾。 22 ? 雙鏈 RNA特異性核酸內(nèi)切酶（ dsRNAspecific endonuclease， Dicer）切割，形成 2123nt的雙鏈短干擾 RNA（ shortinterference RNA， siRNA）， siRNA鏈為 5’端磷酸化， 3’端有二個(gè)堿基以非配對(duì)方式懸垂 。 23 ? siRNA與由蛋白及酶類組成的 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（ RNAInduced Silencing Complex， RISC）結(jié)合后，由于 RISC具有解旋酶活性， siRNA中的正義鏈和反義鏈解旋、解鏈。隨后正義鏈被降解，而與 RISC結(jié)合的反義鏈則按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶 mRNA中的同源序列結(jié)合，并由 RISC發(fā)揮核酸內(nèi)切酶作用，在距siRNA3’斷 11或 12個(gè)堿基處切割靶 mRNA。 24 ? 倍增放大作用： siRNA一方面可引導(dǎo)RISC特異性切割靶 mRNA；另一方面， siRNA還可作為引物與靶 mRNA結(jié)合，在 RNA依賴性 RNA多聚酶（ RNAdependent RNA polymerase， RdRp）的作用下合成新的 dsRNA，再次經(jīng) Dicer酶切割，形成新的 siRNA，并作用于靶mRNA。 25 RNA干擾 26 微小 RNA（ microRNA） ? 微小 RNA（ microRNA）大量存在人類基因組中的非編碼 RNA，能特異識(shí)別成熟 mRNA的 3’非翻譯區(qū)，抑制 mRNA的翻譯。 ? 微小 RNA（ microRNA） 1993 年 Lee等在對(duì)秀麗線蟲進(jìn)行突變體的遺傳分析中首次發(fā)現(xiàn)的不能編碼蛋白質(zhì)，但能時(shí)序調(diào)控其胚胎后期發(fā)育基因表達(dá)的 miRNA:Lin一 4。 27 ? 2022年 Reinhart等在線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一 種重要的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用的miRNA:let一 7，后來發(fā)現(xiàn)了大量類似RNA， 2022年起統(tǒng)一稱為 miRNA。 28 ? miRNA通常來源于一個(gè)大小約為 1000bp的 長(zhǎng)鏈 RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 (Pri一 miRNA)， Pri一miRNA分子在細(xì)胞核中經(jīng)過雙鏈 RNA特異性核酸酶 Rnaselll一 Drosha的作用形成 70100nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 RNA分子 (pre一 miRNA)。 pre一miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一 5(Exportin一 5)的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中，被另一個(gè)雙鏈 RNA特異性核酸酶Rnaselll一 Dicer識(shí)別，進(jìn)一步被切割成長(zhǎng)約 22nt的小分子 RNA，即成熟的 miRNA。成熟 miRNA在RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物引導(dǎo)下，當(dāng)與 mRNA完美互補(bǔ)時(shí)， miRNA便指導(dǎo) mRNA特異性切割 。當(dāng)兩者沒有足夠的互補(bǔ)性時(shí)， miRNA則抑制 mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯。 29 ? 隨著人類后基因組計(jì)劃的進(jìn)一步開展，占類基因組 90%以上的非編碼序列越來越引起科學(xué)家的關(guān)注，據(jù)計(jì)算推測(cè)，人類基因組可能存在 1000多個(gè) miRNA基因， ? 單個(gè) miRNA可調(diào)控 200多個(gè)靶基因，約1/3的蛋白編碼基因受 miRNA調(diào)控。 30 ? miRNA是調(diào)節(jié)真核生物基因表達(dá)的天然反義寡核昔酸鏈。研究表明， miRNA參與了生命過程中一系列的重要過程，包括發(fā)育進(jìn)程、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡等，與許多疾病的發(fā)生、診斷、治療和預(yù)后密切相關(guān)， miRNA也因而成為當(dāng)前研究的新熱點(diǎn)。 31 ? 免疫調(diào)節(jié) 將抗原、抗體或細(xì)胞因子基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，改變其免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。如可將白細(xì)胞介素 2 （ IL2）導(dǎo)入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人（ IL2）的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的活性。 32 ? 許多腫瘤都能表達(dá)一些腫瘤特異的抗原，