【正文】 （二）、基因治療的基因?qū)胂到y(tǒng) ? 基因?qū)胂到y(tǒng)（ gene delivery system）是基因治療的核心技術(shù)，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。原則上，各種類型的病毒都能被改造成病毒載體。研究病毒載體首先要對病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能有充分的了解，最好能獲得病毒基因組全序列信息。 44 ? 各種野生型病毒顆粒都具有一定的包裝容量，即對所包裝的病毒基因組的長度有一定的限制。 45 ? 然而，這樣的重組病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體有許多缺點(diǎn)。因此，必須刪除更多的病毒基因以騰出位置插入較大的外源 DNA。 瞬間 細(xì)胞 細(xì)胞膜核膜通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細(xì)胞 （ 2）顯微注射法（ microinjection ） 利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核 不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因 DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備 重組基因 DNA 微注射 （體外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 動(dòng)物模型：轉(zhuǎn)基因鼠 (每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳 ) clone sheep Dolly 體細(xì)胞 提取 核 重組細(xì)胞 回植 Dolly 卵細(xì)胞 去核 細(xì)胞 （ 3）微粒子轟擊法 ? 利用亞微粒的 鎢 和 金 能吸附 DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。 3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。 多聚陽離子與配體共價(jià)連接后 ， 又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的 DNA結(jié)合 ， 將 DNA包圍 ，只留下配體暴露于表面 。 有如普通治療藥物 , 商業(yè)化發(fā)展方向所在 。這些細(xì)胞被暴露在帶有目的基因的病毒中?；蚴潜贿\(yùn)送到患者細(xì)胞中，但這些細(xì)胞存在于患者體外。 ? 由于有著床前診斷技術(shù)，生殖細(xì)胞基因治療已無必要。 77 （五）、基因治療在單基因遺傳病、腫瘤和心血管疾病治療上的應(yīng)用 遺傳病的治療 遺傳病的治療分為三個(gè)層次： （ 1）生理水平的治療 —— 對癥治療 苯丙酮尿癥 —— 限制膳食中苯丙氨酸含量 白 化 病 —— 戴帽子和墨鏡 （ 2）蛋白質(zhì)水平治療 向病人體內(nèi)補(bǔ)充缺失的蛋白質(zhì)。病兒從肺、胰腺等處分泌粘液，阻礙呼吸、消化等功能。 1990 年第一例基因治療臨床試驗(yàn)使腺苷酸脫氨酶（ ADA）基因進(jìn)入骨髓細(xì)胞，再送回病人體內(nèi)，治療嚴(yán)重綜合免疫缺失癥（ SCID）獲得初步效果。 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺失癥（ SCID）患兒從出生時(shí)起就必須生活在隔離室中。 1991年 1月，另一名患同樣病的女孩也接受了同樣的治療。常規(guī)治療以輸血和血制品為主，既會(huì)引起嚴(yán)重輸血反應(yīng)，還容易感染病毒，此外還因凝血因子在血液中半衰期短，需要經(jīng)常性輸入，不僅不方便而且治療費(fèi)用昂貴。 91 ? 目前， 血友病 B的基因治療取得了一定的進(jìn)展，但在大動(dòng)物和人體試驗(yàn)的結(jié)果還不夠理想，需進(jìn)一步提高 hFIX的表達(dá)水平以提高治療的有效性和安全性。 ? Rb基因缺陷會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌和膀胱癌等腫瘤，將正常的 Rb基因?qū)胍暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，該細(xì)胞將失去致瘤能力。 94 ? 在癌基因的反義基因治療中，目前已經(jīng)選取的靶基因很廣泛，癌基因包括 csrc、 cfos、 Hras、 Kras、 cmyc等；自分泌的生長因子及其受體基因包括 IGF IGF1受體、 EGF、 TGFα等。因此可以通過以下方法糾正機(jī)體腫瘤的免疫耐受狀態(tài)。 97 ? （ 2）、制備腫瘤 DNA瘤苗 許多腫瘤都能表達(dá)一些腫瘤特異的抗原，將這些在正常機(jī)體內(nèi)不表達(dá)的腫瘤特異抗原的編碼基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，通過其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)從而可以激發(fā)機(jī)體對編碼抗原的免疫反應(yīng)。腫瘤免疫細(xì)胞因子基因治療因其簡單、有效、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法。 自殺基因的作用機(jī)制 ?TK/GCV 單純皰疹病毒 （ herps simplex virus, HSV）Ⅰ 型胸苷激酶 （ thymidine kinase, tk） 基因編碼胸苷激酶 ， 特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ ganciclovir, GCV） 轉(zhuǎn)變成毒性 GCV三磷酸核苷 ，后者能抑制 DNA聚合酶活性 ， 導(dǎo)致細(xì)胞死亡 。 （六）基因治療面臨的問題和挑戰(zhàn) ? 基因治療的發(fā)展經(jīng)歷了“樂觀與熱情 —失望與懷疑 —理性與挑戰(zhàn)”的過程，這是符合事物發(fā)展規(guī)律的。若靜脈注射，病毒顆粒將很快被清除，真正能夠到達(dá)腫瘤組織的很少，難以達(dá)到治療效果，且增加了副作用。 108 ? (3)理想的基因治療應(yīng)能根據(jù)病變的性質(zhì)和嚴(yán)重程度不同，調(diào)控治療基因在適當(dāng)?shù)慕M織器官內(nèi)和以適當(dāng)?shù)乃交蚍绞奖磉_(dá)。但是，沒過多久，檢查出 1名兒童患上某種類似白血病，有關(guān)專家認(rèn)為這是由基因治療引起的。擔(dān)心病毒載體會(huì)破壞重要基因，導(dǎo)致 “插入型突變 ” ?？赏ㄟ^改造逆轉(zhuǎn)錄酶病毒減少插入變異的風(fēng)險(xiǎn)。美國費(fèi)城杰弗遜醫(yī)學(xué)院的研究人員已經(jīng)成功地在動(dòng)物身上實(shí)現(xiàn)了用基因治療的方法預(yù)防胃癌。 1990— 1995年為狂熱期。對臨床試驗(yàn)進(jìn)行評估，提出關(guān)鍵問題進(jìn)行研究，從狂熱轉(zhuǎn)入理性化的正常軌道。迄今所有的藥物，都是通過修飾基因的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)、改變?nèi)梭w的基因表達(dá)，改變基因產(chǎn)物的功能從而達(dá)到治療的目的，是間接的 “ 基因治療 ” 。 發(fā)展與展望