【正文】 第三章 酶反應(yīng)的觀察 Observation of enzyme reactions 在第二章，我們已經(jīng)討論了各種測量溶液中快速反應(yīng)的技術(shù)。其中， Stoppedflow 和 Tjump兩種方法在觀察酶反應(yīng)方面已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng) 用。所觀察的變化尤以吸收和熒光變化為最普遍。對那些含生色團(tuán)，像 血紅素 (Heme), 核黃素 (Flavin), 磷酸吡哆醛（ Pyridoxal phosphate)等的 酶特別適合于這些技術(shù)的應(yīng)用。我們可以把這些生色團(tuán)視為觀察酶反應(yīng) 的天然探針。 然而，許多酶（如大多數(shù)水解酶）并不含這種天然探針，就要采用人 工探針或特殊裝置。 對于可以觀察光吸收或熒光變化的酶反應(yīng)，根據(jù)觀察對象的不同，可 以把這些酶分成三組： 1. 酶自身（它的必需生色團(tuán)或蛋白部分）； 2. 配基（底物和底物類似物， NAD+ 型輔酶； 3. 指示劑或探針（不參與反應(yīng)，但起到報(bào)告酶分子上發(fā)生變化的 作用）。 由于檢測技術(shù)的發(fā)展，快速反應(yīng)技術(shù)在研究各類酶反應(yīng)已獲得廣泛 應(yīng)用。本章通過討論一些實(shí)例，介紹檢測酶反應(yīng)的技術(shù)。 第一節(jié) 酶自身光學(xué)性質(zhì)的變化 這些變化可以分成三組： （ 1）必需原子團(tuán)（包括輔基）的吸收或熒光光譜的變化； （ 2）酶蛋白的差吸收光譜； （ 3）酶蛋白質(zhì)的熒光變化。 下面我們僅討論（ 2）和 （ 3）兩種情況。 一 . 酶蛋白質(zhì)的差吸收光譜 當(dāng)配基與酶結(jié)合的瞬間或隨后的過程，在 260nm310nm范圍，可以 觀察到由于酶蛋白 Trp或 Tyr微環(huán)境的變化所引起的差吸收光譜。一般來 說， 這種變化很小， ΔA/A（ A為背景，即蛋白質(zhì)本身的吸收）范圍在 %。這種較小的變化適合于 Stoppedflow法的測量，而不適合于 T jump法的測量。 但在有些情況，在 300nm附近，觀察 glucoamylase 和底物麥芽糊精 結(jié)合所引起的吸收變化。在這一波長，背景吸收較小， ΔA/A較大。在 300 nm附近的變化，只少可以部分地歸于 trp靜電環(huán)境的變化。 Fig. 是這種測量的例子。如果， ΔA/A值較大，也可以進(jìn)行 Tjump測量。 葡萄糖淀粉酶結(jié)合底物的特征差吸收譜和 Stoppedflow 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) (a) 差光譜， , 25 ℃ ， [E]0 = 22 ?M。 [S]0=。 I. 在混合后 12sec觀察， 代表穩(wěn)態(tài)差譜； 7min觀察，反應(yīng)完成。 (b) 同一反應(yīng)的 Stoppedflow時(shí)間曲線。 303 nm, pH , 5 ℃ ， 10 mm Cell, [E]0= ?M, [S]0=。 二 . 酶蛋白質(zhì)熒光變化 在 280nm激發(fā)，對大多數(shù)酶，可以得到中心在 300380nm的熒光光 譜，主要是由 Trp和（或） Tyr殘基產(chǎn)生的。配基與酶結(jié)合引起的熒光光 譜變化，有些報(bào)道的例子。一般來說， ΔF/F要比差吸收光譜的情況 (ΔA/A)大得多。因而 Stoppedflow和 Tjump法都適合于測量酶熒光的這 種變化。 是葡萄糖淀粉酶和麥芽寡糖引起的酶熒光的變化的例 子。 利用蛋白質(zhì)熒光進(jìn)行 Stoppedflow測量的例子 [E]0= ?M。 [S]0=。 pH , 5 ℃ 。 在底物結(jié)合后，峰位在 340nm的蛋白質(zhì)熒光減少 20%. 累加 8次后平均 一次時(shí)間曲線 第二節(jié) 配基光學(xué)性質(zhì)的變化 利用配基光學(xué)性質(zhì)的變化可以監(jiān)測酶反應(yīng)，其中包括底物化學(xué)變化 （廣義上也包括輔酶），酶與配基非共價(jià)結(jié)合而引起的配基光學(xué)性質(zhì)的 變化。 一 .配基化學(xué)變化 在有脫氫酶催化的反應(yīng)中 ,輔酶 NAD(P)+(CoII)發(fā)生如下變化 , 同時(shí) 伴隨吸收和熒光變化 . 乳酸脫氫酶催化下述反應(yīng) , N A D ( P ) + N A D ( P ) HL 乳 酸 + N A D + ( C o I ) 丙 酮 酸 + N A D H由 Tjump法得到的該反應(yīng)的弛預(yù)過程如 . NAD+ NADH相互轉(zhuǎn)化時(shí)在 340nm的變化 Tjump弛預(yù)曲線 , ΔT: 0 ℃ ℃ Llactate: 2mM。 NAD+: 10 mM。 豬心乳酸脫氫酶 :2mg/ml 二 . 配基與酶非共價(jià)結(jié)合引起的配基光學(xué)性質(zhì)的變化 某些核苷酸，如 NAD+或 NADH與酶結(jié)合時(shí)常常發(fā)生吸收或熒光光 譜的變化。甘油醛三磷酸脫氫酶（ Glyceraldehyde3phosphate Dehydrogenase) 結(jié)合 NAD+時(shí)，在 360nm出現(xiàn)一條新帶，叫 Racker Band, 這對監(jiān)測酶反應(yīng)很有用。利用 Tjump法已成功研究了該酶與 NAD+ 的相互作用。然而，一般來說， NADH與酶的結(jié)合所引起的變化要比 NAD+與酶的結(jié)合容易觀察。用 NAD+取代酶結(jié)合的 NADH的 Stopped Flow 時(shí)間曲線見 , 其中， NAD+是大過量的。 Fig. 測量酶結(jié)合的 NADH吸收 變化的例子 用大過量的 NAD+取代 酶結(jié)合的 NADH的時(shí)間過程。 觀察波長： 340nm。 55?M 醇脫氫酶 + 40 ?M NADH 20 mM NAD+ + M NaCl 混合 透 過 率 變 化 % 50 msec 15% 第三節(jié) 指示劑或探針的使用 如果反應(yīng)不發(fā)生吸收變化或熒光變化，那么為了監(jiān)測反應(yīng)可以人為 地加入指示劑或探針。 一 . pH 指示劑 伴有可解離基團(tuán) pK值改變的反應(yīng)，通常涉及質(zhì)子的結(jié)合或釋放?？梢杂?pH 指示劑跟蹤反應(yīng)過程。反應(yīng)體系微小的 pH的變化就會引起 pH指示劑吸收的變化。 pH指示劑法已廣泛用于快速反應(yīng)的測量，特別是 TJump法。 pH指示劑本身 H+ 轉(zhuǎn)移非?？欤ǔ２坏??Sec, 因此弛預(yù)時(shí)間大于 10 ?Sec的反應(yīng)，可用該法測量， 且安全可靠。 例如， Tjump法測量枯草桿菌蛋白酶 BPN‘(Subtilisin BPN‘)結(jié)合苯硼酸（ Benzene Boronic Acid) 的反應(yīng)，使用了對 硝基苯酚作 pH指示劑。苯硼酸代表絲氨 酸蛋白酶一種可能的過度態(tài)類似物。結(jié)果如 。 使用 pH指示劑進(jìn)行 Tjump 測量 的例子。 [E]0= 124 ?M 。 [苯硼酸 ]0= mM pH , 25 ℃ , ΔT = 3℃ [pH指示劑 ]=100 ?M , ?nm=400nm 20mV 500 ?sec 每格 每格 反應(yīng)引起的 pH指示劑的吸收變化與反應(yīng)引起的 pH變化、指示劑濃度和 指示劑的 pK值相關(guān)。 根據(jù)理論計(jì)算，選擇 pKa值接近測量條件下的 pH值的指示劑比較好。 二 . 酶結(jié)合的探針 把特殊的染料以共價(jià)或非共價(jià)形式連接到酶分子上，起到報(bào)告在反應(yīng) 過程中酶分子發(fā)生變化的作用。 1. 可逆結(jié)合探針 活性部位探針（酶與配基的相互作用） 原黃素（ Prolavine)和猩紅（ Biebrich scarlet)作為探針可以結(jié)合到酶 的活性部位。在吸收譜上可以看到所伴隨的變化。 原黃素和猩紅的分子結(jié)構(gòu) 原黃素適合于標(biāo)記 Chymotrypsin 和 Trypsin。 而猩紅適合于標(biāo)記 Lysozyme 和 Chymotrypsin。 在 Stoppedflow實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)?shù)孜铮ɑ虻孜镱愃莆铮┡c酶結(jié)合時(shí)，就 會形成酶 染料 配基三元復(fù)合物，結(jié)果光譜發(fā)生變化。通過染料吸收譜的 變化，可以監(jiān)測配基的結(jié)合。有人曾利用原黃素作為探針研究了 Chymotrypsin與抑制劑間相互作用，差光譜圖和 Stoppedflow是間過程 如 。 ?Chymotrypsin 與 SSI (鏈霉菌枯草桿菌蛋白酶抑制劑） (a) 差光譜（ EdyeSSI) 10msec 每格 每格 [E]0= ?M 。 [Dye]0= ?M 。 [SSI]0= 0 (0 ?M ), 1. ( ?M )。 2. ( ?M)。 3. ( ?M)。 4. ( ?M ) (b) SSI 與酶結(jié)合的 Stoppedflow trace. SSI Proflavine E Proflavine At 460nm [E]0= ?M。 [Dye]0 = ?M 。 [SSI]0 = ?M 2. 共價(jià)結(jié)合探針 探針與酶共價(jià)結(jié)合，可以消除探針與酶間的結(jié)合平衡。在蛋白質(zhì)中， 氨基酸的反應(yīng)基團(tuán)如 SH, ?NH2(Lys)很適合于化學(xué)修飾。當(dāng)然，這種探針 的引入不應(yīng)明顯影響酶的活力。 例如， Burr和 Koshland 把作為報(bào)告基團(tuán)的染料 2溴乙酰氨基 4硝基苯酚 （ 2bromoacetamido4nitrophenol) 共價(jià)結(jié)合到 Chymotrypsin 的蛋氨酰殘 基上。由于對 硝基苯酚基團(tuán)靜電環(huán)境的變化，引起解離狀態(tài)的改變。這種 變化反映在 400nm附近光譜的變化上。此外 MNP(2chlomercuri4 Nitrophenol)可與 SH反應(yīng)，作為靜電環(huán)境的探針。 第四章 酶快速反應(yīng)的分析 Analysis of Fast Enzyme Reaction Transient Kiics 在第二節(jié)中已經(jīng)談到了酶反應(yīng)的瞬變相。對于一個(gè)一級反應(yīng)來說， 由快速反應(yīng)技術(shù)所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) ， 即反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程曲線 ， 在大多數(shù) 情況下 ， 可以用一個(gè)單指數(shù)曲線或多個(gè)指數(shù)曲線的迭加 （ 稱為符合一級 反應(yīng) ） 來表示 。 由這些曲線可以計(jì)算反應(yīng)的弛豫時(shí)間 （ τ ） 或表觀的一 級速度常數(shù) （ kapp） 。 表觀的一級速度常數(shù) （ kapp） 通常是反應(yīng)物濃度的函數(shù) 。 為解釋反應(yīng) 機(jī)制 ， 需要由表觀的一級速度常數(shù)計(jì)算各個(gè)反應(yīng)階段的速度常數(shù) ， 即微 觀速度常數(shù) 。 第一節(jié) 弛豫時(shí)間 或表觀一級速度常數(shù)的計(jì)算 進(jìn)行動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析要做的第一件事是由反應(yīng)曲線計(jì)算表觀的一級 速度常數(shù) 。 停流法和溫度跳躍法比較容易進(jìn)行重復(fù)測量 ， 因而可以獲 得速度常數(shù)的平均值 。 一 .由單指數(shù)曲線計(jì)算表觀的一級速度常數(shù) kapp標(biāo)準(zhǔn)程序 典型的一級速度方程有如下形式 dχ /dt =a + bx （ ) X是一個(gè)與時(shí)間相關(guān)的變量 ， 它與反應(yīng)期間的濃度變化線性相關(guān) 。 a和 b是常 數(shù) （ b0） 。 對 χ = A + B et/? （ ） 其中 ?是弛豫時(shí)間 ， 1/?是一級速度常數(shù) kapp， A和 B是常數(shù) 。 χ 0和 χ ∞ 分別代表 χ 的初值和終值 。 即 當(dāng) t = 0 是 ， χ 0= A + B ； t = ∞ ， χ ∞ = A；因此 ， A =χ ∞ ， B =χ 0χ ∞ ， 將它們代入 , Ln[(x–x∞ )/(χ 0χ ∞ )]= (1/τ ） t （ ） 由 Ln∣ χ χ ∞ ∣ ~ t 圖的斜率可以得到 kapp。 這是計(jì)算 kapp的 標(biāo)準(zhǔn)程 序 。 然而 ， 問題并非如此簡單 。 如果能準(zhǔn)確測量 χ ∞ ， 當(dāng)然 ， 這種方法很簡單 。 由于 kapp對 χ ∞ 很敏感 ， χ 0χ ∞ 值 2%的誤差 ， 可以引起 kapp值 10%的差 。 另外 ， 有時(shí)準(zhǔn)確測量 χ ∞ 很困難 。 如果用計(jì)算機(jī)的話 ， 可以利用試探誤差 法 （ trialanderror） ， 通過改變 χ ∞ 值 ， 一直到 Ln ?χ χ ∞ ? ? t圖有 最好的線性擬合 。 對于不知道 χ ∞ 的情況 ， 可以采用 Guggenheim作圖法求 kapp。 作圖法 Guggenheim指出 ， 在一級反應(yīng)中 ， 可以通過測量 t時(shí)的 χ 值 （ χ t） 和 t + △ t時(shí)的 χ 值 （ χ t+ ?t） ， 然后以 log ?χ t+ ?t χ t?對 t作圖 ， 給出一直 線 ， 其中 △ t為不變的時(shí)間間隔 ， 直線的斜率就是一級速度常數(shù) k 。 △ t 的 選擇對 k值有影響 ， 最好選擇 12倍的 t1/2值作為 △ t。 這一程序可以用圖