【正文】 . . . .ELISA灰區(qū)的設(shè)置及質(zhì)控方法ELISA測定的陽性判斷值，通常是將大量陰性和陽性人群的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后確定的，其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最低。在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測定結(jié)果可歸為可疑，亦即ELISA測定的“灰區(qū)”。“灰區(qū)”的大小可用統(tǒng)計學(xué)方法確定。測定結(jié)果處于“灰區(qū)”的樣本，可通過確認(rèn)試驗或追蹤檢測來確定到底是陽性還是陰性。”?！盎覅^(qū)”的大小可用統(tǒng)計學(xué)方法確定??具體是怎么確定的。或者大概粗略的方法計算是怎么樣的呢？？高手在哪呢ELISA“灰區(qū)”是把定量分析的正常值范圍引入定性分析而建立的概念?；覅^(qū)的設(shè)置有二種：（1）（1177。C）， C為該試劑的批內(nèi)C (一般在1520%間）；（2）177。2S，S為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控ROC的S。另外，個人認(rèn)為：ELISA“灰區(qū)”對于不同項目和應(yīng)用的領(lǐng)域不同,其設(shè)置不能一概而論。根據(jù)美國疾病控制中心（CDC）對美國Ortho的抗HC檢測的ELISA試劑盒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)只有檢驗結(jié)果S/CO≥，高度預(yù)示HC抗體真陽性狀態(tài)；若檢驗結(jié)果S/CO，存在較高的假陽性。 在血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員抗HC篩查用上述兩種灰區(qū)的設(shè)置方法沒有什么不可；如果臨床實驗室抗HC的灰區(qū)也按前者設(shè)置，勢必存在較多的假陽性，如何設(shè)置灰區(qū)應(yīng)該是值得研究和商榷的。這位老師好，不好意思，本人愚昧，還不是很清楚這兩種方法在實際的應(yīng)用，可否舉一個小例子。比如HBsAg，結(jié)果是陰性，但是是有很明顯顏色的。在血站系統(tǒng)這樣的血就不敢用，怎么解決呢，我們經(jīng)常遇到測量陰性但是有顏色的標(biāo)本，用不同廠家的試劑或是同種試劑重復(fù)實驗還是一樣，又擔(dān)心存在弱抗體的問題。怎么解決呢，除非不做空白。其cutoff的公式一般為NC*。我只是舉例。別找問題以外的事情來說呀，我等答案等得著急第三章ELISA技術(shù)的質(zhì)量控制概述Engall和Perlmann于1971年首先建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。隨著科技的發(fā)展，ELISA在抗原、抗體、酶、固相載體及包被技術(shù)等方面都有較大的進(jìn)步，其靈敏度和特異性均大大提高。由于該技術(shù)具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點，因而已被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。盡管如此，ELISA在應(yīng)用過程中仍然存在著許多難點，必須嚴(yán)格控制才能保證檢測的質(zhì)量。ELISA質(zhì)量保證是一個復(fù)雜的過程，許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測的質(zhì)量?，F(xiàn)分述如下：一、方法學(xué)的影響ELISA測定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競爭抑制法，其中競爭抑制法因受操作時差所引起的不公平競爭等因素的影響，結(jié)果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。二、試劑因素免疫檢測的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。由于該反應(yīng)過程受多種因素的影響，如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等，因而檢測結(jié)果難以溯源，不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平，因此在引入新項目之前必須對試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評估。試劑的評估有以下幾個步驟：⑴確定開展該項目的必要性；⑵了解該項目現(xiàn)有的檢測方法和原理；⑶在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較，判斷標(biāo)準(zhǔn)首選參考方法或參考物質(zhì)，其次為臨床的滿意度及權(quán)威機(jī)構(gòu)的報告如各級室間質(zhì)量評價、CDC報告等；⑷定期對檢測結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。不同批次的ELISA試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結(jié)果也存在差異，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件。嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。試劑使用前必須平衡至室溫，否則會影響檢測下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。三、樣本因素標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，前者包括類風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等，后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們在檢測過程中可以避免也是必須避免的因素，而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見的疑難病例時應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進(jìn)行簡要說明： 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。 標(biāo)本的采集及血清分離要注意盡量避免細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中除可能含有內(nèi)源酶對測定產(chǎn)生非特異性干擾外，還可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。另外標(biāo)本在保存中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。 標(biāo)本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底加深、甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常情況下血清標(biāo)本可在2～8℃下保存l周，冷凍保存時間會更長，但對于抗體或抗原含量低的標(biāo)本而言，則可能會因抗體掉價、抗原分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。 血液通常在采集后半小時后開始凝固，18～24h完全凝固。如果在血液未凝固時即離心分離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。為了縮短標(biāo)本處理時間，可以在離心前將血液標(biāo)本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。 標(biāo)本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價跌落從而引起假陰性結(jié)果，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝凍存。此外，標(biāo)本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標(biāo)本必須混勻，但不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。四、操作因素對ELISA結(jié)果的影響ELISA測定一般遵循以下步驟：固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色目前各種形式的ELISA自動分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場，如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機(jī)械磨損或者推動桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，尤其是對于樣本量較大的臨床實驗室，因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加樣時速度不可太快，避免將標(biāo)本加在孔壁上部 ，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時還應(yīng)當(dāng)注意操作時差對結(jié)果的影響，操作時差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時間的差異。操作時差在每個實驗中都存在，尤其是手工操作，日常檢測標(biāo)本多達(dá)幾百個，從加入第一個標(biāo)本到最后一個標(biāo)本，需幾十分鐘，加入試劑及混勻等均存在著前后的時間差異，使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時間不一致，操作時差對競爭法檢測的結(jié)果影響更大，在加酶結(jié)合物和底物時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外還要注意滴加的速度，速度太快，容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或者加在兩孔之間，造成非特異性吸附。另外有些項目在檢測前需要稀釋以減低非特異性反應(yīng)，但稀釋的方式非常重要，如果采用手工稀釋則容易因操作者個體差異而產(chǎn)生不一致的結(jié)果，尤其是吸光度處于臨界值附近的標(biāo)本，因此最佳的方式是采用振蕩器混勻。在 ELISA檢測中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫 育(incubation)。溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。有實驗表明，抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2小時產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩以增加抗原抗體接觸的機(jī)會?？乖贵w反應(yīng)在4℃反應(yīng)更為徹底，形成的產(chǎn)物更多更穩(wěn)定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。溫育的方式有溫箱法、微波輻射法、水浴法等，其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（這種現(xiàn)象被稱為“邊緣效應(yīng)”）。若用溫箱溫育則ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。采用這種溫育方式的關(guān)鍵是必須保證濕盒內(nèi)的溫度達(dá)到反應(yīng)的要求，可在反應(yīng)前將濕盒預(yù)溫至規(guī)定的溫度，并用溫度計監(jiān)測反應(yīng)過程。采用水浴時，將ELISA板置于