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第二章微生物實驗室常用試劑、培養(yǎng)基(已修改)

2025-04-19 04:00 本頁面
 

【正文】 微生物學(xué)實驗室常用試劑與培養(yǎng)基 29 / 29第一節(jié) 常用試劑及其使用方法一、診斷用紙片⑴ 桿菌肽紙片():抑菌圈10mm為敏感。質(zhì)控菌株: D群鏈球菌陰性, A群鏈球菌陽性。 ⑵ SMZ紙片(、):出現(xiàn)抑菌圈即為敏感。質(zhì)控菌株:D群鏈球菌陽性, A群鏈球菌陰性。 ⑶ 新生霉素紙片():抑菌圈≥16mm為敏感。質(zhì)控菌株:表皮葡萄球菌陽性, 腐生葡萄球菌陰性。 ⑷ O129紙片、奧普托欣(Optochin)紙片:參見第五節(jié)《生化試驗培養(yǎng)基》。二、診斷用血清⑴ AF群O多價診斷血清。⑵ 特異O群因子診斷血清:常用的有O2,O4,O7,O9,O10診斷血清。⑶ 特異H因子診斷血清 常用的有Ha,Hb,Hc,Hd,Hgm,Hi,Hf、Vi因子診斷血清。 志賀菌屬4種多價血清:痢疾志賀菌Ⅰ、Ⅱ血清,福氏志賀菌多價血清及分型血清(1~6型),宋內(nèi)志賀菌診斷血清,鮑氏志賀菌多價血清及分型血清。腸致病性大腸埃希菌(EPEC)診斷血清,產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌(ETEC)診斷血清,腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)診斷血清,腸出血性大腸埃希菌(EHEC)診斷血清O157: H 7。 、O139混合多價診斷血清及稻葉、小川、彥島O139分型血清 三、常用染色液⑴ 結(jié)晶紫溶液 A液:結(jié)晶紫 20g,95%乙醇20 ml; B液:草酸銨 , 蒸餾水80 ml。染色前24h將A液、 B液混合,過濾后裝入試劑瓶內(nèi)備用。⑵ 碘液:碘1g,碘化鉀2g,蒸餾水300ml。將碘與碘化鉀混合并研磨,加入幾毫升蒸餾水, 使其逐漸溶解,然后研磨,繼續(xù)加入少量蒸餾水至碘、碘化鉀完全溶解。最后補足水量。也可用少量蒸餾水將碘化鉀完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。⑶ 脫色液:95%乙醇⑷ 復(fù)染液:,95%乙醇100ml為貯存液,取貯存液10ml,加蒸餾水90ml為應(yīng)用液。 ⑴ 堿性復(fù)紅染色液: ①萋納石炭酸復(fù)紅溶液:堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液10ml,5%石炭酸溶液90ml。 ②脫色液:濃鹽酸3ml,95%乙醇97ml。③復(fù)染液(呂弗勒美藍(lán)液):美藍(lán)乙醇飽和溶液30ml,100g/,蒸餾水100ml。⑵ 金胺O羅丹明B染色液: ①羅丹明B液:羅丹明B 。②1g/L金胺O液:,再加入純石炭酸 5ml,混勻。③3%鹽酸乙醇。④稀釋美藍(lán)液:呂弗勒美藍(lán)液100ml,加蒸餾水90ml,混勻。(改良Ryu法)A液:5%石炭酸10ml,鞣酸2g,飽和硫酸鋁鉀溶液 10ml; B液:結(jié)晶紫乙醇飽和液。應(yīng)用液A液10份,B液1份,混合,室溫存放備用。甲液:甲苯胺藍(lán) ,孔雀綠 2g/L, 95% ,蒸餾水100ml。乙液:碘 2g,碘化鉀3g,蒸餾水300ml。 先將碘化鉀加入少許蒸餾水(約2ml),充分振搖,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后, 加蒸餾水至300ml。⑴ 印度墨汁或50g/L黑色素水溶液⑵ 5g/L苯胺藍(lán)水溶液。第二節(jié) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基一、液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基[用途]用于細(xì)菌靛基質(zhì)試驗;一般細(xì)菌培養(yǎng)和傳代。 [配法] 蛋白胨(或胰蛋白胨)10g,氯化鈉 5g,蒸餾水1L。將上述成分溶于水中,校正pH ,分裝試管,每管2~3ml,置121℃滅菌15min備用。 [質(zhì)量控制]大腸埃希菌生長良好,靛基質(zhì)陽性;傷寒沙門菌生長良好,靛基質(zhì)陰性。[用途] 一般細(xì)菌的增菌培養(yǎng),加入1%的瓊脂粉亦可作營養(yǎng)瓊脂。[配法] 蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,蒸餾水1L。 將上述成分稱量混合溶解于水中,按用途不同分裝于燒瓶或試管內(nèi)。經(jīng)121℃滅菌15min,作無菌試驗后冷藏備用。 [質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、化膿性鏈球菌生長良好。[保存] 置冰箱3周內(nèi)用完。 [用途] 細(xì)菌培養(yǎng)最基礎(chǔ)的培養(yǎng)基,除用于一般細(xì)菌的培養(yǎng)外,又可以作營養(yǎng)瓊脂及其它培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。 [配法] 新鮮除脂牛肉 500g,氯化鈉5g蛋白胨10g,蒸餾水1L。 先將牛肉清洗,除脂肪、肌腱,并切塊絞碎。稱取500g置容器加入蒸餾水1L,攪勻后置冰箱過夜,次日煮沸加熱30min,并用玻棒不時攪拌用絨布或麻布進(jìn)行粗過濾,再用脫脂棉過濾即成。在過濾中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g溶解后,~,并加熱煮沸10min,補充蒸餾水至1L,最后用濾紙過濾,呈清晰透明、淡黃色液體,經(jīng)121℃15min滅菌備用。[用法]根據(jù)用途不同可以制成營養(yǎng)肉湯,以此為基礎(chǔ)制成其它培養(yǎng)基。如制作固體培養(yǎng)基,加入瓊脂15 ~20g/L即可。[質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌等均生長良好。[保存] 置4℃冰箱內(nèi)可以使用較長時間。注:商品牛肉浸膏粉,一般使用量為3~5g/L。二、固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基[用途] 一般細(xì)菌和菌株的純化及傳種。 [配法] 蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化鈉5g,瓊脂粉(優(yōu)質(zhì))12g,蒸餾水1L。 將上述成分(除瓊脂外)溶于水中,校正pH ~,煮沸溶解,根據(jù)用途不同進(jìn)行分裝,經(jīng)121℃滅菌15min,傾注平板或制成斜面,冷藏備用。 [質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌菌落呈淺黃色; 痢疾志賀菌菌落無色;銅綠假單胞菌 菌落無色或淺綠色。[保存] 置4℃冰箱保存,2周內(nèi)用完。[用途] 一般病原菌的分離培養(yǎng)和溶血性鑒別及保存菌種。[配法] pH ~ 100ml,脫纖維羊血(或兔血) 5~10ml。 將血瓊脂基礎(chǔ)經(jīng)121℃滅菌15min,待冷卻至50℃左右以無菌手續(xù)加入羊血,搖勻后立即傾注滅菌平皿內(nèi),待凝固后,經(jīng)無菌實驗冷藏備用。 [質(zhì)量控制] 化膿性鏈球菌ATCC 19615生長良好,β溶血;肺炎鏈球菌ATCC 6303生長良好,α溶血;表皮葡萄球菌ATCC 12228 生長良好,不溶血。[保存] 置4℃冰箱,1周內(nèi)用完。 [用途] 主要用于嗜血桿菌的分離培養(yǎng),亦可用于奈瑟菌的增殖培養(yǎng)。 [配法] 鮮牛肉浸出液1L, 蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂粉12g,無菌脫纖維羊血或兔血100ml。將上述成分(除兔血外)加熱溶解,置121℃15min高壓滅菌,待冷至約85℃,以無菌方式加入兔血,搖勻后置85℃水浴中,維持該溫度10min,使之成巧克力色。取出置室溫冷至約50℃,傾注平板或制成斜面?zhèn)溆谩? [質(zhì)量控制] 流感嗜血桿菌ATCC 1021肺炎鏈球菌ATCC 6305生長良好,菌落典型。[保存] 置4℃冰箱,1周內(nèi)用完。 [用途] 常用于測定腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及營養(yǎng)要求較高細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗。 [配法] , 胰化酪蛋白20g,氯化鈉5g,,蒸餾水1L。將上述成分(酚紅除外)混合溶解,加入酚紅指示劑。分裝試管,115℃滅菌15min。[用法]用于測定糖發(fā)酵時,按需要加入各種糖溶液,將待檢標(biāo)本直接種于培養(yǎng)基管內(nèi),置35℃孵箱,18~24h觀察結(jié)果。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色為陽性,不變色為陰性。第三節(jié) 保存和增菌培養(yǎng)基一、菌種保存培養(yǎng)基 [配法] 蛋白胨10g,牛肉膏5g,氯化鈉3g,磷酸氫二鈉2g,蒸餾水1L 。 將上述成分混合于水中,加熱溶解,~,分裝試管2/3左右高度,121℃高壓滅菌15min,成為半固體培養(yǎng)基,備用。 [質(zhì)量控制] 培養(yǎng)基呈淡黃色半固體狀。大腸埃希菌(ATCC 25922)生長良好,動力陽性;福氏志賀菌(ATCC 12022)生長良好,動力陰性;金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)生長良好,動力陰性。二、增菌培養(yǎng)基 [用途] 用于血液增菌。 [配法] 蛋白胨(或月示 胨)10g,氯化鈉5g,肉浸液(或心浸液)1L,葡萄糖3g,枸櫞酸鈉3g,5g/L對氨基苯甲酸水溶液10ml,1mol/L硫酸鎂溶液20ml,青霉素酶1000 U。 將蛋白胨、氯化鈉混合于肉浸液中加熱溶解,再加入葡萄糖、枸櫞酸鈉、對氨苯甲酸及硫酸鎂,繼續(xù)煮沸5min,并補足失水。過濾分裝,每瓶50ml,高壓滅菌115℃20min后,每瓶加入青霉素酶50 U,經(jīng)無菌試驗合格后,冷卻備用。 [用法] 將采取的血液標(biāo)本,以無菌手續(xù)注入培養(yǎng)瓶中(血液1ml,培養(yǎng)液10ml),置35℃培養(yǎng)箱內(nèi),每天1次取出觀察結(jié)果。如有細(xì)菌生長,可出現(xiàn)數(shù)種不同的表現(xiàn),應(yīng)隨時作分離培養(yǎng),可選用血瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂及巧克力瓊脂平板等。無細(xì)菌生長表現(xiàn)的培養(yǎng)瓶,需連續(xù)觀察7d,仍無細(xì)菌生長方可棄去。在觀察的過程中,至少應(yīng)作兩次分離培養(yǎng)。注:⑴ 枸櫞酸鈉為抗凝劑,可使血液加入培養(yǎng)基中不凝固。 ⑵ 對氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。 ⑶ 硫酸鎂主要抑制血液中存在的四環(huán)素、金霉素、新霉素、多粘菌素及鏈霉素的抑菌作用。⑷ 本培養(yǎng)基近年來有許多改良配方,%~%酵母浸膏以增加營養(yǎng);%核酸刺激細(xì)菌生長;%粘液素能被覆于細(xì)菌的表面,保護(hù)細(xì)菌免受抗體破壞;加入聚茴香腦磺酸鈉(SPS)能中和補體的抗藥作用從而提高檢出率。 [用途] 血液和骨髓液病原菌的增菌培養(yǎng)。 [配法] 蛋白胨10g,氯化鈉5g,牛肉膏3g,葡萄糖1g,酵母膏粉3g,枸櫞酸鈉3g,磷酸氫二鉀2g,5g/L對氨基苯甲酸溶液5ml,1mol/L硫酸鎂溶液20ml, 4g/L酚紅溶液6ml,青霉素酶50 U,聚茴香腦磺酸鈉(SPS) ,蒸餾水1L。 將上述成分(除酚紅指示劑、青霉素酶外)混合加熱溶解,再加酚紅,過濾分裝每瓶30~50ml,經(jīng)121℃滅菌15min和35℃24h無菌試驗備用。~ U青霉素酶。[質(zhì)量控制] 傷寒沙門菌ATCC 5009白色念珠菌ATCC 1023化膿性鏈球菌ATCC 1961肺炎鏈球菌ATCC 630金黃色葡萄菌ATCC 2592銅綠假單胞菌ATCC 27853均生長良好。 [用途] 沙門菌增菌培養(yǎng)。 [配法] 蛋白胨5g,乳糖4g,,亞硒酸氫鈉4g,蒸餾水1L。 先將亞硒酸鹽加到200ml蒸餾水中,充分搖勻溶解。其它成分稱量混合,加入蒸餾水800ml,加熱溶解,待冷卻后兩液混合,充分搖勻,校正pH ~(通過調(diào)整磷酸鹽緩沖對的比例來校正pH值)。最后分裝于15150mm的試管內(nèi),每管10ml。置水浴隔水煮沸10~15min,立即冷卻,置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。[用法] 取新鮮標(biāo)本1g或棉拭子采樣直接種于該培養(yǎng)管內(nèi)。搖動后置35℃培養(yǎng)過夜。如發(fā)現(xiàn)均勻混濁,管底有紅色沉淀物,表示細(xì)菌生長。然后取培養(yǎng)物分離在選擇性培養(yǎng)基上,如SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板等,進(jìn)行培養(yǎng)。[質(zhì)量控制]培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色或無色,透明無沉淀物。增菌靈敏度:傷寒沙門菌1105,鼠傷寒及副傷寒沙門菌1107。[保存]4℃保存,1周內(nèi)用完。注:⑴ 亞硒酸鹽,包括亞硒酸鈉、亞硒酸氫鈉均可使用,但以亞硒酸氫鈉效果為好。 ⑵ 磷酸鹽緩沖對中,兩者的用量比例與亞硒酸鹽及蛋白胨的品種有關(guān)。制備前應(yīng)進(jìn)行調(diào)試,其總量為10g/L。 ⑶ 在制備過程中,亞硒酸鹽不能直接加熱。隔水煮沸時間亦不能超過規(guī)定時間,否則亞硒酸鹽會變質(zhì),生成紅色沉淀物。⑷ 培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色,有紅色沉淀物出現(xiàn)時不可再用。 [用途] 用于沙門、志賀菌的增菌。 [配法]月示 胨 2g,蛋白胨8g,酵母膏2g,葡萄糖2g,枸櫞酸鐵10g,硫代硫酸鈉10g,,磷酸氫二鈉4g,去氧膽酸鈉(進(jìn)口) ,蒸餾水1L。 將上述成分加熱溶于水中,分裝試管(15150mm),每管5~7ml,隔水煮沸5min備用。[用法] 取糞便標(biāo)本1g直接種于增菌液內(nèi),35℃16~18h培養(yǎng),取出轉(zhuǎn)種于分離培養(yǎng)基即可。 [質(zhì)量控制] 培養(yǎng)基應(yīng)呈淡黃色或略呈淡綠色。傷寒沙門菌ATCC 5009福氏志賀菌ATCC 12022 生長良好;大腸埃希菌ATCC 25922 生長抑制。注:⑴ 切勿高壓,隔水煮沸時間不超過5min。 ⑵ 煌綠用量應(yīng)根據(jù)不同產(chǎn)品批號酌情增減。 [用途] 霍亂弧菌增菌培養(yǎng)。 [配法] 蛋白胨 20g,氯化鈉5g,蒸餾水100ml。 將上述成分溶解于水中,校正pH ,分裝于試管8~10ml,經(jīng)121℃滅菌15min備用。[用法] 將待檢標(biāo)本接種到堿性胨水中,置35℃培養(yǎng)6~8h,霍亂弧菌呈均勻混濁生長,表面有菌膜出現(xiàn)。取表面菌液一白金環(huán)移種到堿性瓊脂、慶大瓊脂或TCBS瓊脂平板上。必要時做第二次增菌。[質(zhì)量控制] 有條件的實驗室可用標(biāo)準(zhǔn)菌株,一般臨床實驗室可用非01群弧菌,培養(yǎng)后生長良好者方可使用?;魜y弧菌E1Tor生物型和副溶血弧菌生長良好(6h);大腸埃希菌ATCC 25922不生長(6h)。[保存] 置4℃冰箱,2周內(nèi)用完。注:若在每升堿性胨水中加入1%~ ml,則成為亞碲酸鉀堿性胨水,其增菌效果更為理想。第四節(jié) 分離培養(yǎng)基 一、革蘭陽性桿菌分離培養(yǎng)基 [用途]
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