【正文】 5℃滅菌30min，連續(xù)3天，經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)證明無(wú)雜菌生長(zhǎng)即可應(yīng)用。 (呂氏血清斜面)[用途] 用于白喉棒狀桿菌培養(yǎng)。[保存]置4℃冰箱內(nèi)2~4周有效。再添放馬鈴薯粉，邊放邊攪，并繼續(xù)置沸水中加熱30min，待冷卻至60℃左右時(shí)，加入雞卵液1L及孔雀綠溶液20ml，充分混勻后，用無(wú)菌操作分裝于滅菌試管，每支5~6ml，塞緊橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器內(nèi)制成斜面，經(jīng)85℃1h間歇滅菌2次(或高壓滅菌115℃20min)，待凝固后經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)，4℃冷藏備用。注：若在每升堿性胨水中加入1%~ ml，則成為亞碲酸鉀堿性胨水，其增菌效果更為理想。必要時(shí)做第二次增菌。 [配法] 蛋白胨 20g，氯化鈉5g，蒸餾水100ml。傷寒沙門菌ATCC 5009福氏志賀菌ATCC 12022 生長(zhǎng)良好；大腸埃希菌ATCC 25922 生長(zhǎng)抑制。 [配法]月示 胨 2g，蛋白胨8g，酵母膏2g，葡萄糖2g，枸櫞酸鐵10g，硫代硫酸鈉10g，磷酸氫二鈉4g，去氧膽酸鈉(進(jìn)口) ，蒸餾水1L。 ⑶ 在制備過(guò)程中，亞硒酸鹽不能直接加熱。[保存]4℃保存，1周內(nèi)用完。如發(fā)現(xiàn)均勻混濁，管底有紅色沉淀物，表示細(xì)菌生長(zhǎng)。最后分裝于15150mm的試管內(nèi)，每管10ml。 [用途] 沙門菌增菌培養(yǎng)。 [配法] 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸櫞酸鈉3g，磷酸氫二鉀2g，5g/L對(duì)氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸鎂溶液20ml， 4g/L酚紅溶液6ml，青霉素酶50 U，聚茴香腦磺酸鈉(SPS) ，蒸餾水1L。 ⑵ 對(duì)氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。如有細(xì)菌生長(zhǎng)，可出現(xiàn)數(shù)種不同的表現(xiàn)，應(yīng)隨時(shí)作分離培養(yǎng)，可選用血瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂及巧克力瓊脂平板等。 [配法] 蛋白胨(或月示 胨)10g，氯化鈉5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸櫞酸鈉3g，5g/L對(duì)氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸鎂溶液20ml，青霉素酶1000 U。 將上述成分混合于水中，加熱溶解，~，分裝試管2/3左右高度，121℃高壓滅菌15min，成為半固體培養(yǎng)基，備用。分裝試管，115℃滅菌15min。[保存] 置4℃冰箱，1周內(nèi)用完。 [配法] 鮮牛肉浸出液1L， 蛋白胨10g,氯化鈉5g，瓊脂粉12g，無(wú)菌脫纖維羊血或兔血100ml。 將血瓊脂基礎(chǔ)經(jīng)121℃滅菌15min，待冷卻至50℃左右以無(wú)菌手續(xù)加入羊血，搖勻后立即傾注滅菌平皿內(nèi)，待凝固后，經(jīng)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)冷藏備用。 [質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌菌落呈淺黃色； 痢疾志賀菌菌落無(wú)色；銅綠假單胞菌 菌落無(wú)色或淺綠色。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量為3～5g/L。[用法]根據(jù)用途不同可以制成營(yíng)養(yǎng)肉湯，以此為基礎(chǔ)制成其它培養(yǎng)基。 [配法] 新鮮除脂牛肉 500g，氯化鈉5g蛋白胨10g，蒸餾水1L。經(jīng)121℃滅菌15min，作無(wú)菌試驗(yàn)后冷藏備用。 [質(zhì)量控制]大腸埃希菌生長(zhǎng)良好，靛基質(zhì)陽(yáng)性；傷寒沙門菌生長(zhǎng)良好，靛基質(zhì)陰性。⑴ 印度墨汁或50g/L黑色素水溶液⑵ 5g/L苯胺藍(lán)水溶液。應(yīng)用液A液10份,B液1份,混合,室溫存放備用。②1g/L金胺O液：,再加入純石炭酸 5ml,混勻。 ⑴ 堿性復(fù)紅染色液： ①萋納石炭酸復(fù)紅溶液：堿性復(fù)紅乙醇飽和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。將碘與碘化鉀混合并研磨,加入幾毫升蒸餾水, 使其逐漸溶解,然后研磨,繼續(xù)加入少量蒸餾水至碘、碘化鉀完全溶解。腸致病性大腸埃希菌（EPEC）診斷血清，產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌（ETEC）診斷血清，腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）診斷血清，腸出血性大腸埃希菌（EHEC）診斷血清O157： H 7。二、診斷用血清⑴ AF群O多價(jià)診斷血清。質(zhì)控菌株：D群鏈球菌陽(yáng)性， A群鏈球菌陰性。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用試劑與培養(yǎng)基 29 / 29第一節(jié) 常用試劑及其使用方法一、診斷用紙片⑴ 桿菌肽紙片（）：抑菌圈10mm為敏感。 ⑶ 新生霉素紙片（）：抑菌圈≥16mm為敏感。⑵ 特異O群因子診斷血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10診斷血清。 、O139混合多價(jià)診斷血清及稻葉、小川、彥島O139分型血清 三、常用染色液⑴ 結(jié)晶紫溶液 A液：結(jié)晶紫 20g，95%乙醇20 ml； B液：草酸銨 ， 蒸餾水80 ml。最后補(bǔ)足水量。 ②脫色液：濃鹽酸3ml，95%乙醇97ml。③3%鹽酸乙醇。甲液：甲苯胺藍(lán) ，孔雀綠 2g/L， 95% ，蒸餾水100ml。第二節(jié) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基一、液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基[用途]用于細(xì)菌靛基質(zhì)試驗(yàn)；一般細(xì)菌培養(yǎng)和傳代。[用途] 一般細(xì)菌的增菌培養(yǎng)，加入1%的瓊脂粉亦可作營(yíng)養(yǎng)瓊脂。 [質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、化膿性鏈球菌生長(zhǎng)良好。 先將牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切塊絞碎。如制作固體培養(yǎng)基，加入瓊脂15 ~20g/L即可。二、固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基[用途] 一般細(xì)菌和菌株的純化及傳種。[保存] 置4℃冰箱保存，2周內(nèi)用完。 [質(zhì)量控制] 化膿性鏈球菌ATCC 19615生長(zhǎng)良好，β溶血；肺炎鏈球菌ATCC 6303生長(zhǎng)良好，α溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生長(zhǎng)良好,不溶血。將上述成分（除兔血外）加熱溶解，置121℃15min高壓滅菌，待冷至約85℃，以無(wú)菌方式加入兔血，搖勻后置85℃水浴中，維持該溫度10min，使之成巧克力色。 [用途] 常用于測(cè)定腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及營(yíng)養(yǎng)要求較高細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)。[用法]用于測(cè)定糖發(fā)酵時(shí)，按需要加入各種糖溶液，將待檢標(biāo)本直接種于培養(yǎng)基管內(nèi)，置35℃孵箱，18~24h觀察結(jié)果。 [質(zhì)量控制] 培養(yǎng)基呈淡黃色半固體狀。 將蛋白胨、氯化鈉混合于肉浸液中加熱溶解，再加入葡萄糖、枸櫞酸鈉、對(duì)氨苯甲酸及硫酸鎂，繼續(xù)煮沸5min，并補(bǔ)足失水。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)的培養(yǎng)瓶，需連續(xù)觀察7d，仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)方可棄去。 ⑶ 硫酸鎂主要抑制血液中存在的四環(huán)素、金霉素、新霉素、多粘菌素及鏈霉素的抑菌作用。 將上述成分（除酚紅指示劑、青霉素酶外）混合加熱溶解，再加酚紅，過(guò)濾分裝每瓶30～50ml，經(jīng)121℃滅菌15min和35℃24h無(wú)菌試驗(yàn)備用。 [配法] 蛋白胨5g，乳糖4g，亞硒酸氫鈉4g，蒸餾水1L。置水浴隔水煮沸10~15min，立即冷卻，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ缓笕∨囵B(yǎng)物分離在選擇性培養(yǎng)基上，如SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板等，進(jìn)行培養(yǎng)。注：⑴ 亞硒酸鹽，包括亞硒酸鈉、亞硒酸氫鈉均可使用，但以亞硒酸氫鈉效果為好。隔水煮沸時(shí)間亦不能超過(guò)規(guī)定時(shí)間，否則亞硒酸鹽會(huì)變質(zhì)，生成紅色沉淀物。 將上述成分加熱溶于水中，分裝試管（15150mm），每管5~7ml，隔水煮沸5min備用。注：⑴ 切勿高壓，隔水煮沸時(shí)間不超過(guò)5min。 將上述成分溶解于水中,校正pH ，分裝于試管8~10ml，經(jīng)121℃滅菌15min備用。[質(zhì)量控制] 有條件的實(shí)驗(yàn)室可用標(biāo)準(zhǔn)菌株，一般臨床實(shí)驗(yàn)室可用非01群弧菌，培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好者方可使用。第四節(jié) 分離培養(yǎng)基 一、革蘭陽(yáng)性桿菌分離培養(yǎng)基 [用途] 用于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。[用法] 取晨咳痰或其它體液標(biāo)本，（約2滴）滴種于培養(yǎng)基的斜面上，盡量搖晃，置35℃5%~10%二氧化碳溫箱內(nèi)培養(yǎng)1~4周，觀察結(jié)果。注：⑴ 本培養(yǎng)基由LowensteinJenden設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上改良。[配法]1%葡萄糖肉湯(pH )100ml，無(wú)菌動(dòng)物血清(牛、羊、豬、兔) 300ml。[用法] 將喉拭子直接接種于上述斜面上，置35℃培養(yǎng)16~24h。⑶ 配制時(shí)所有器皿、棉塞等均應(yīng)高壓滅菌。待冷至50℃左右，用無(wú)菌操作加入已滅菌的亞碲酸鉀溶液及羊血，混勻傾注平板。 二、革蘭陰性桿菌分離培養(yǎng)基 (一)弧菌分離培養(yǎng)基 [用途] 用于霍亂弧菌分離培養(yǎng)。置35℃培養(yǎng)12~16h，觀察結(jié)果。ELTor弧菌生長(zhǎng)良好；大腸埃希菌ATCC 25922 生長(zhǎng)抑制。將上述成分稱量混合于水中加熱溶解，分裝121℃滅菌15min，傾注平板。其它細(xì)菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。 [配法]蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化鈉5g，枸櫞酸鈉10g，無(wú)水亞硫酸鈉3g，蔗糖(或白糖)10g，瓊脂15~20g，慶大霉素、多粘菌素B“雙抗液”2ml，蒸餾水1L。 由于該培養(yǎng)基抑制性強(qiáng)，其它非弧菌科細(xì)菌被抑制，而霍亂弧菌生長(zhǎng)迅速，16h菌落可達(dá)2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑濕潤(rùn)。注：⑴ 該培養(yǎng)基國(guó)內(nèi)有商品出售，多數(shù)產(chǎn)品已加入慶大霉素，使用時(shí)，應(yīng)詳閱說(shuō)明書(shū)。 [配法] 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉浸膏3g，亞硫酸鈉(無(wú)水)3g，枸櫞酸鈉10g，豬膽汁粉5g，十二烷硫酸鈉20g，利凡諾（雷佛奴爾）3g，瓊脂粉12g，慶大霉素亞碲酸鉀混合液 1ml，蒸餾水1L。24h培養(yǎng)后，霍亂弧菌呈中心黑色、較大而扁平的菌落。成品培養(yǎng)基應(yīng)避光保存。待冷卻至50℃左右，加入中國(guó)藍(lán)、薔薇紅酸乙醇溶液混勻，立即傾注平板，凝固后備用。[保存] 4℃冰箱保存，1周內(nèi)用完。(3)此培養(yǎng)基pH ，應(yīng)呈淡紅色。將上述成分(酚紅除外)混合，加熱溶解，,再加入酚紅溶液混勻。[質(zhì)量控制]大腸埃希菌呈黃色菌落；宋內(nèi)志賀菌呈無(wú)色菌落；傷寒沙門菌 呈紅色菌落有黑心；金黃色葡萄球菌 抑制生長(zhǎng)。將上述成分(除中性紅、煌綠外)混合于水中，加熱煮沸溶解，~，然后加入中性紅和煌綠溶液，充分混勻冷卻至50℃時(shí)傾注平板。[保存] 避光，3天內(nèi)用完。將上述成分(除中性紅外)稱量加入水中，加熱溶解，加入中性紅溶液，分裝滅菌115℃20min，冷卻至50℃左右時(shí)傾注平板。[保存] 置4℃冰箱(避光)，1周內(nèi)用完。將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂稱量混合于水中，并加熱煮沸溶解，校正pH至 ，分裝121℃滅菌15min備用。[質(zhì)量控制] 大腸埃希菌菌落呈紫紅色，有時(shí)有金屬光澤，直徑＞；傷寒沙門菌菌落呈灰白色，直徑＞；金黃色葡萄球菌不生長(zhǎng)。將前8種成分稱量混合于水中，加熱溶解，再加入瓊脂和酚紅溶液，煮沸溶解分裝試管，每管4ml，經(jīng)115℃滅菌20min，立即制成高層斜面，待凝固后經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)備用。產(chǎn)硫化氫菌株可使底層或全管產(chǎn)生黑色反應(yīng)。 [用途] 用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化鑒定。[用法] 取待檢菌純培養(yǎng)物，用接種針作底層穿刺和斜面劃線接種，置35℃培養(yǎng)18~24h觀察結(jié)果。分解乳糖或蔗糖后產(chǎn)氣時(shí)有些菌株還能使培養(yǎng)基斷裂。 [用途] 用于致病性、侵襲性和產(chǎn)毒性大腸埃希菌分離培養(yǎng)。臨用時(shí)，加熱溶解，再加山梨醇、結(jié)晶紫及中性紅溶液，搖勻傾注平板。[質(zhì)量控制] 參照麥康凱瓊脂。將上述成分加熱、溶解，分裝試管，118~121℃滅菌15min，制成斜面和高層備用。 [配法] （1）HughLeifson培養(yǎng)基(革蘭陰性桿菌用)：蛋白胨2g，葡萄糖10g，磷酸氫二鉀 ，氯化鈉5g，溴麝香草酚藍(lán)（BTB），瓊脂 ，蒸餾水1L。置35℃孵箱培養(yǎng)24~48h。(2)指示劑不能用乙醇配制，因有些細(xì)菌可使乙醇產(chǎn)酸，導(dǎo)致發(fā)酵或氧化反應(yīng)影響結(jié)果判斷。另外分別配新鮮L半胱氨酸溶液（）及焦磷酸鐵溶液（），分別過(guò)濾除菌，再加入已滅菌瓊脂中， 加入1mol/L 氫氧化鉀溶液4～～，可用1mol/L 鹽酸溶液校正，傾注平板，冷卻后置4℃冰箱備用，亦可制成斜面，用于保存菌種。在BCYE平板上，培養(yǎng)4～5 天，菌落直徑約1～2mm，并出現(xiàn)亮藍(lán)和切削玻璃樣的構(gòu)造；繼續(xù)培養(yǎng)后菌落增大呈黃綠色，較光滑。待冷至50℃，搖勻，傾注無(wú)菌平板。②?、僖?ml，再加萬(wàn)古霉素100mg和多粘菌素B ，搖勻后即可。3）彎曲菌運(yùn)送可用布氏菌湯培養(yǎng)基。[用法]取標(biāo)本接種于平板，置25℃或43℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48h，菌落直徑達(dá)1~2 mm，不溶血。 將上述成分混合后，加熱溶解。將分離的純菌接種到糖（醇）發(fā)酵管中，置35℃培養(yǎng)18～24h。先取血清25ml、蒸餾水75ml混合，置阿諾滅菌器內(nèi)加熱15min，以破壞血清內(nèi)的淀粉酶。[用法] 將被檢菌接種培養(yǎng)基，置35℃培養(yǎng)18~24h。將上述成分混合加熱溶解，分裝試管，115℃滅菌15min。[保存] 置4℃冰箱，2周內(nèi)用完。加熱慢慢溶解，按10g/L濃度加入所需要的氨基酸，呈深亮紫色。陽(yáng)性菌初期由于細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸呈黃色，若繼續(xù)孵育，氨基酸經(jīng)脫羧產(chǎn)生胺類使培養(yǎng)基變堿，指示劑改變顏色，呈紫色或紫紅色。 [用途] 用于檢測(cè)細(xì)菌所產(chǎn)生的耐熱脫氧核糖核酸酶。將載玻片孵育于35℃濕盒內(nèi)4h,取出觀察結(jié)果。[配法]DNA 2g，胰酪胨15g，大豆胨5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L。 [質(zhì)量控制] 金黃色葡萄球菌ATCC 25923和粘質(zhì)沙雷菌 ATCC 274陽(yáng)性。 [配法]鹽酸二甲基對(duì)苯二胺（或四甲基對(duì)苯二胺）。 [質(zhì)量控制]銅綠假單胞菌ATCC 27853陽(yáng)性；大