【正文】 核酸和蛋白質(zhì)分析技術(shù) 第一節(jié) 核酸分析技術(shù) ? 講述內(nèi)容： 核酸電泳 雜交技術(shù) PCR技術(shù) 基因芯片 一、核 酸 電 泳 ? （一） DNA的凝膠電泳 ? 凝膠電泳是分子克隆的中心技術(shù)之一。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于 200～ 1000bp的片段 。 操作簡(jiǎn)單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離 5－ 500bp的片段 。 效果好、分辨率極高，相差 1bp的 DNA片斷就能分開(kāi)，能容納相對(duì)大量的 DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析 瓊脂糖凝膠電泳的基本過(guò)程 ? 材料 ： 電泳緩沖液（常用 TAE或 TBE）、電泳級(jí)瓊脂糖、溴化乙錠溶液（核酸顯示劑）、加樣緩沖液（保證核酸不在加樣孔中擴(kuò)散和用于電泳時(shí)間的指示系統(tǒng)）、水平凝膠電泳裝置及制膠系統(tǒng)、直流電源系統(tǒng)。 ? 基本過(guò)程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時(shí)間后停止電泳 取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果 ? 注意：溴化乙錠具有致癌性，操作時(shí)要帶手套 不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍 瓊脂糖濃度 （％， W/ V ) DNA分子的有效分離范圍（ kb) 影響 DNA在凝膠中遷移 速率 的因素： ? 1 DNA分子的大小 ? 2 構(gòu)象 ? 3 凝膠濃度 ? 4 電壓 ? 5 緩沖液 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡過(guò)程中 DNA Ladder的形成 PCR產(chǎn)物的瓊脂 糖電泳 聚丙烯凝膠電泳的銀染結(jié)果分析 特殊的凝膠電泳 ? 倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳（ FIGE）：用于分離分子量 10～ 2022kb的 DNA分子； ? 鉗位均勻電場(chǎng)電泳（ CHEF電泳）：可分離大于 107bp的 DNA分子 基本過(guò)程同 DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)?RNA分子對(duì) RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對(duì) RNA酶有抑制作用 DEPC水 來(lái)配置所有溶液，所有與 RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少 RNA酶對(duì)樣品的降解；另外，因?yàn)?RNA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 （二） RNA 電 泳 二 核酸雜交技術(shù) ? （一） Southern Blot ? 原理： 將待檢測(cè)的 DNA分子用 /不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。 用途：檢測(cè)樣品中的 DNA及其含量，了解基因的狀態(tài) , 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。 Southern Blot 操作步驟： DNA 瓊脂糖電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色 ? 原理 ： 在變性條件下將待檢的 RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 ， 繼而按照同 Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè) 。 ? 用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 （ mRNA）及其含量 。 （二） Northern Blot 操作過(guò)程 mRNA提取 甲醛變性電泳 印跡轉(zhuǎn)移 預(yù)雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或化學(xué)發(fā)光 （三）探針標(biāo)記技術(shù) ? 1 標(biāo)記物 ： 放射性和非放射性兩種 ? 放射性： ? 非放射性： 生物素 、 地高辛素 、熒光素 ? 標(biāo)記方法 ? （ 1） 切口平移法 ? （ 2）隨機(jī)引物法 ? （ 3）末端標(biāo)記法 ? （ 4）單鏈 DNA探針標(biāo)記 ? （ 5） 寡核苷酸探針標(biāo)記法 32P、 35S和 3H 三 PCR技術(shù) ? PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對(duì)寡聚 DNA作為引物，通過(guò)加溫變性－退火－ DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的 DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng) 25－ 30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá) 106。 ? Dr. Karry Mullis 1985年發(fā)明，獲 1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)； 目的 : 用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的 DNA區(qū)段。 （一）原理： 雙鏈 DNA通過(guò)高溫變性解離成互補(bǔ)單鏈 DNA －－－ 變性 ↓ 與一對(duì)寡核苷酸引物（ 5’， 3’）降低溫度退火 DNA加熱變性 +引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱(chēng)為 退火 ↓ 適溫延伸 5’/3’引物形成新鏈變成 4條鏈 DNA －－ 延伸 ↓ 第二輪：變性 — 退火 — 延伸 ?呈指數(shù)增長(zhǎng) 理論值：一輪一倍 10輪 103=1000倍 20輪 106 30 輪 109 理論 模板擴(kuò)增 30輪 1ng1g 實(shí)際 模板擴(kuò)增 30輪 1ng10?g ?1 Taq DNA聚合酶 ： ? 水生棲熱菌 (thermus aquaticus,Taq)的 DNA聚合酶 ? ① 5’?3’DNA聚合酶活性； ? ②無(wú) 3’?5’外切酶活性 ， ? 35輪 %錯(cuò)配 ， 與原始模板有差別； ? 最適聚合酶 溫度 72℃ ，選擇 72℃ 延伸 ? 半衰期： ℃ 130min ? 95℃ 40min ? ℃ 5— 6min ? 變性溫度： ≤ 95℃ 使其在整個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中保持足夠活性 （二）基本要素 pfu DNA 聚合酶 ? 耐熱 ? 5’?3’DNA聚合酶活性 ? 3’→ 5’外切酶活性 ? 精確度： pfu Taq 但 pfu擴(kuò)增效率通常比 Taq酶略差 ? 文獻(xiàn)報(bào)道： Taq+pfu 會(huì)起到較好效果 ? ? 2 .引物 ? 人工合成短寡核苷酸 20bp