醫(yī)學]07生化技術ta(已修改)
2025-01-16 05:52 本頁面
【正文】 生物大分子的分離、純化、鑒定、定量技術 總 論 常用 生物大分子的分離純化技術 特殊 要求的分離純化方法 生化與分子生物學 生化與分子生物學的研究對象：生物內的 分子 生 化： 所有生物體內的分子，包括糖類、脂類、蛋白質、 核酸、有機小分子等 代謝與調控 分子生物學： 最初是 生物大分子 ，即蛋白質、核酸 , 現也是所有細胞內的 分子 ,是生物化學的高級階段 , 基因水平 分子醫(yī)學 分子遺傳學 分子免疫學 分子病理學 分子藥理學 分子毒理學 分子檢驗學 分子腫瘤學 …… 分子生物學已成為工具性學科，已滲透到生命科學領域包括醫(yī)學的每一分支學科中 ,從這點講它已不是獨立的學科 . ? 諾貝爾獎近百年的歷史，在 91項生理學或醫(yī)學獎中有 31項與生化與分子生物學有較密切的關系，而化學獎中則有 34項相關；尤其是 20世紀五十年代以來， 52％的生理或醫(yī)學獎和 40％的化學獎屬于生化與分子生物學領域，二者之和相當于另外設立了一個生化與分子生物學諾貝爾獎。 生物化學技術與分子生物學技術 ? 生物化學技術 分子的分離純化鑒定定量 包括分光、層析、電泳、離心、超濾等 ? 分子生物學技術 基因、分子水平的系列操作， 把生化、微生物免疫等技術相結合形成系統， 包括 PCR技術、基因克隆表達技術、分子雜 交印跡、單克隆抗體技術、 RNAi技術、基因 敲除、基因診斷與基因治療、芯片技術、 mRNA差異顯示技術等 得到高質量的符合要求的研究材料是進行分子生物學研究面臨的首要問題，也是關鍵性的第一步 對特定生物分子進行定性 \定量分析是最常用的研究策略 １ .層析技術 ２ .電泳技術 ３ . 分光技術 ４ .離心技術 一、常用生化分離純化技術 層析技術 ? 基本原理 層析系統都由互不相溶的兩相溶劑（固定相和流動相）組成，利用樣品各組分的物理化學性質的差異，使待分離的各組分以不同程度分布在兩相中，以不同速度隨流動相移動，最終達到分離目的。 在一定溫度下達到平衡后，某種溶質在兩相中的濃度比是個常數，稱分配系數（ KD），它是物種的特征常數之一。 ? 溶質在固定相中濃度 ? KD=—————————— ? 溶質在流動相中濃度 系統組成 ? 固定相（介質） ? 惰性支持物 ? 流動相（展層劑） 常見層析技術類型 ? 按 原 理 分 ? 吸附層析 ? 分配層析 ? 吸附分配層析 ? 離子交換層析 ? 分子篩層析（凝膠層析） ? 親和層析 ? 共價層析 按 裝 置 分 柱層析 薄層層析 紙層析 液相層析 高效液相層析 /色譜（ HPLC） 氣相色譜 ? 通常把原理、裝置和固定相結合起來命名： DEAE纖維素柱層析 活性碳吸附柱層析 瓊脂糖凝膠層析 分辨率與分離效率 分辨率 ? 以層析系統的溶劑體積相對溶質濃度作圖，相鄰兩峰的分開程度稱為分辨率。分辨率反映了分離的效果。 ? 裝置的形狀尺寸（例如柱層析中柱的長度、直徑），以及物質的分配系數均影響分辨率。分配系數 差異越大 ，則分離峰相距愈遠，分辨率越高；對柱層析而言，柱越長越細，分辨率越高。 ? 分離效率 ? 單位時間內分離溶質的量稱分離效率，對柱層析來說稱柱效率。分配系數 差異越大， 柱越短越粗，分辨率越高 柱層析 梯度混合器 固定相不同原理不同 ? 吸附層析：吸附力差異 活性炭、硅藻土、纖維素、氧化鋁 ? 分配層析：分配系數（溶解度）差異 濾紙 ? 離子交換層析：極性差異 離子交換樹脂、羧甲基纖維素 CM、 DEAE ? 分子篩層析（凝膠層析）：分子大小 葡聚糖 Sephadex和瓊脂糖凝膠 Sepharose ? 親和層析：專一吸附力（配基或配體、受體） 薄層層析與紙層析 ? 展層時分配系數不同的溶質在薄層板上移動速率不同而得到分離 ? 用于小分子分離分析 原點到層析點中心的距離 遷移率 Rf= 原點到溶劑前沿的距離 萃取與分配層析不同 ? 甲乙物質在固定相 A 、流動相 B中 分配系數不同： A60 B30 A40 B20
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