醫(yī)學(xué)]07 生化技術(shù)ta-文庫(kù)吧
2024-12-20 05:52 本頁(yè)面
【正文】 A20 B10 A24 B12 36 9 A30 B60 A20 B40 A10 B20 A12 B24 36 甲 乙 高效液相層析 ? HPLC利用高壓泵產(chǎn)生的高壓力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相流過(guò)色譜柱 ? 很高的柱效率（分辨率），有高壓、高速、高靈敏度、易自動(dòng)化等特點(diǎn)，靈敏度高達(dá) 10— 9g（紫外檢測(cè)），甚至 10— 11g（熒光檢測(cè)） 梯 度 洗 脫裝 置 高 壓 輸液泵 進(jìn)樣裝置 樣品 色 譜 柱 餾分裝置 流動(dòng)相 貯液器 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)檢測(cè) 圖 9 HPLC的裝置和操作 電泳技術(shù) ? 帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。電泳技術(shù)依據(jù)生物分子在溶液中 帶電 性質(zhì)及 分子大小、形狀 有差別，從而在電場(chǎng)中的遷移率不同而將其分離純化 分類 按支持介質(zhì)的不同可分為 ⑴ 醋酸纖維薄膜電泳（ Cellulose Acetate electrophoresis） ⑵ 瓊脂凝膠電泳（ Agar Gel electrophoresis） ⑶ 聚丙烯酰胺凝膠（ Polyacrylamide Gel electrophoresis）（ PAGE） ⑷ 等電聚焦電泳 按支持介質(zhì)形狀不同可分為： ⑴ 薄層電泳 ； ⑵ 板電泳（水平、垂直） ； ⑶ 柱電泳 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺電泳（ PAGE） ? 聚丙烯酰胺凝膠由單體丙稀酰胺和 N,N’甲叉雙丙烯酰胺在加速劑和催化劑（四甲基乙二胺， TEMED）作用下交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。具有如下優(yōu)點(diǎn)： ? 一定濃度下，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好 ? 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng) ? 對(duì) pH和溫度變化較穩(wěn)定 ? 幾乎無(wú)電滲作用，樣品分離重復(fù)性較好 ? 樣品不易擴(kuò)散，用量少，靈敏度可達(dá) 10－ 6 g ? 凝膠孔徑可調(diào)節(jié) ? 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中 等 電 聚 焦 電 泳 不同物質(zhì)由于帶電性質(zhì)不同，因而在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下移動(dòng)的方向和速度不同 ,可以進(jìn)行分離。 蛋白質(zhì)具有許多可解離的酸性基團(tuán)（－ COOH）和堿性基團(tuán)（－ NH2）及其它基團(tuán) ,在一定溶液的 pH條件下可解離成帶正電荷或負(fù)電荷的基團(tuán)。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一 pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，成為兼性離子，凈電位為零，此時(shí)溶液的 pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 NH3+ + OH－ NH3+ + OH－ NH2 P P P COOH ＋ H＋ COO－ ＋ H＋ COO－ 蛋白質(zhì)的陽(yáng)離子 蛋白質(zhì)的兼性離子 蛋白質(zhì)的陰離子 ? 以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物，兩性電解質(zhì)（ Ampholine）在支持物內(nèi)形成穩(wěn)定的 pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在電場(chǎng)力的作用下，便會(huì)在支持物中運(yùn)動(dòng)到相當(dāng)于自身 pH梯度中聚合成一狹窄的區(qū)帶而停留。因?yàn)?Ampholine形成的 pH梯度是一較平滑的穩(wěn)定的 pH梯度，從理論上講，只要蛋白質(zhì)的 pI相差 。 ? 血紅蛋白的 pI約在 ，細(xì)胞色素 C的 pI為 ，兩者的 pI相差較大，可以得到較好的分離。 特點(diǎn)：與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)： ⑴生物材料的組成極其 復(fù)雜 ，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。 ⑵許多生物大分子在生物材料中的含 量極微 ，分離純化的步驟繁多， 流程長(zhǎng) 。 ⑶許多生物大分子一旦離開(kāi)了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活 ，因此分離過(guò)程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。 ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種 影響參數(shù) 對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷。 二、生物大分子分離純化的操作 （ 一）破碎、裂解細(xì)胞 動(dòng)物組織 ： 新鮮組織直接在冰上研磨，較堅(jiān)韌的組織勻漿，凍存組織和對(duì)核酸完整性要求高的組織用 液氮研磨 ，加入細(xì)胞裂解液（含蛋
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1