【正文】 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則 [推薦閱讀 ] 第一篇：氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則 附件 5 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑（串聯(lián)質(zhì)譜法）注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。 本指導(dǎo)原則是針對(duì)該類(lèi)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。 本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊(cè)審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。 本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的 不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。 一、適用范圍本指導(dǎo)原則提及的氨基酸、肉堿（包括游離肉堿和?；鈮A）和琥珀酰丙酮分別是指針對(duì)遺傳代謝病的疾病標(biāo)記物。相關(guān) 的 遺 傳 代 謝 病 主 要 包 括 氨 基 酸 代 謝 障 礙（ Disordersofaminoacidmetabolism ）、 脂 肪 酸 氧 化 障 礙（ FattyAcidOxidationdisorders ） 和 有 機(jī) 酸 代 謝 障 礙（ Organicacademiadisorders）等。一般來(lái)說(shuō)，氨基酸是氨基酸代謝障礙的疾病標(biāo)記物，游離肉堿與?；鈮A是脂肪 酸氧化障礙和有機(jī)酸代謝障礙的標(biāo)記物，琥珀酰丙酮是酪氨酸血癥 I 型的主要標(biāo)記物。 遺傳代謝病的發(fā)病機(jī)理為維持機(jī)體正常代謝所必需的酶類(lèi)、受體和載體等蛋白質(zhì)缺陷，導(dǎo)致機(jī)體的生化反應(yīng)和代謝異常，從而引起一系列臨床表現(xiàn)。其臨床表現(xiàn)主要包括神經(jīng)系統(tǒng)損害、代謝紊亂、相關(guān)器官功能異常、生長(zhǎng)遲緩、皮膚及毛發(fā)異常、特殊氣味等。我國(guó)相對(duì)常見(jiàn)的遺傳代謝病如下表所示： 表 1 我國(guó)相對(duì)常見(jiàn)的遺傳代謝病序號(hào)疾病名稱(chēng) 1 高苯丙氨酸血癥（ HPA） 2 甲基丙二酸血癥（ MMA） 3 原發(fā)性肉堿缺乏癥（ PCD） 4 中鏈?；o酶 A脫氫酶缺乏癥（ MCAD） 5極長(zhǎng)鏈?；o酶 A脫氫酶缺乏癥（ VLCAD）6 異戊酸血癥（ IVA） 7 戊二酸血癥 I 型（ GAI） 8 楓糖尿?。?MSUD） 9瓜氨酸血癥 II 型 (希特林蛋白缺乏癥 )（ CITII） 10 瓜氨酸血癥 I 型（ CITⅠ） 11 丙酸血癥（ PA） 12 同型半胱氨酸血癥 I 型（ HCY）遺傳代謝病的臨床檢測(cè)方法一般包括實(shí)驗(yàn)室生化檢測(cè)、影像學(xué)檢測(cè)、負(fù)荷試驗(yàn)、酶學(xué)檢測(cè)、氣相色譜 質(zhì)譜（ GCMS）分析、串聯(lián)質(zhì)譜（ MSMS）分析、基因檢測(cè)等。其中串聯(lián)質(zhì)譜法是臨床檢測(cè)的常用方法，其優(yōu)點(diǎn)包括：具有高分析效率和高靈敏度，能同時(shí)分析多種代謝物， 涵蓋多種遺傳代謝?。? 可重復(fù)性好； 操作相對(duì)簡(jiǎn)單； 干血斑采集和保存方便等。 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑（串聯(lián)質(zhì)譜法）的預(yù)期用途為利用串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，對(duì)全血干血斑樣本中氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮的含量進(jìn)行測(cè)量，相關(guān)待測(cè)分析物濃度及分析物之間相互比例的異常，可能提示某種遺傳代謝病。其原理是使用含有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的溶液對(duì)干血斑進(jìn)行萃取并采用串聯(lián)質(zhì)譜分析，每種待測(cè)分析物對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)程度與它的濃度成比例，根據(jù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度即可計(jì)算分析物的濃度。 該類(lèi)試劑使用的串聯(lián)質(zhì)譜主 要為三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和四極桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（ Qtrap）。掃描模式主要包括以下四種：前體離子（ precursorion,PI）掃描、中性丟失（ NL）掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（ MRM）掃描和產(chǎn)物離子（ production,PI）掃描。前體離子掃描通常用于酰基肉堿的分析檢測(cè)，在第二級(jí)質(zhì)量分析器中選擇特定質(zhì)荷比的產(chǎn)物離子，測(cè)定在第一級(jí)質(zhì)量分析器中一定質(zhì)量范圍內(nèi)所有能產(chǎn)生該碎片的前體離子。中性丟失掃描通常用于氨基酸的分析檢測(cè)，以恒定的質(zhì)量差異，在一定質(zhì)量范圍內(nèi)同時(shí)測(cè)定第一級(jí)、第二級(jí)質(zhì)量分析器中所有的前體離子和產(chǎn)物離子， 檢測(cè)能產(chǎn)生特定中性碎片丟失的前體離子。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描是將第一級(jí)質(zhì)譜設(shè)定為用于篩選特定的前體離子，在第二級(jí)質(zhì)譜中指定所需的產(chǎn)物離子，同時(shí)監(jiān)測(cè)前體離子 產(chǎn)物離子。產(chǎn)物離子掃描是在第一級(jí)質(zhì)量分析器中選擇特定質(zhì)荷比的前體離子，測(cè)定該前體離子在第二級(jí)質(zhì)量分析器中，一定質(zhì)量范圍內(nèi)的所產(chǎn)生的特定產(chǎn)物離子。四種掃描模式各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際中應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性選擇適合的掃描模式。 本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。 本指導(dǎo)原則主要適用于利用串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)干血斑樣本中相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的試劑，包括采 用衍生法處理后對(duì)氨基酸和肉堿進(jìn)行檢測(cè)的試劑和采用非衍生法對(duì)氨基酸、琥珀酰丙酮和肉堿進(jìn)行檢測(cè)的試劑。對(duì)于遺傳代謝病相關(guān)的其他特征分析物或采用其他檢測(cè)方法（如基于抗原抗體反應(yīng)原理方法）、其他樣本類(lèi)型進(jìn)行的檢測(cè)，有利之處可參照?qǐng)?zhí)行。本指導(dǎo)原則不適用于對(duì)相關(guān)疾病的確證和產(chǎn)前篩查項(xiàng)目。 二、注冊(cè)申報(bào)資料要求（一）綜述資料綜述資料主要包括臨床適應(yīng)癥背景情況、產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及其他內(nèi)容。其中，其他內(nèi)容包括同類(lèi)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況，應(yīng)著重從檢驗(yàn)方 法及臨床適用范圍等方面寫(xiě)明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第 5 號(hào)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告 2021 年第 44 號(hào)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)《公告》）的相關(guān)要求。 另外，建議申請(qǐng)人對(duì)以下幾方面內(nèi)容進(jìn)行著重介紹： 、臨床癥狀、臨床發(fā)病率、檢測(cè)方法、治療方法等。 、種類(lèi)、相應(yīng)的內(nèi)標(biāo) 準(zhǔn)品和質(zhì)控品、經(jīng)臨床驗(yàn)證的遺傳代謝病與分析物間的對(duì)應(yīng)關(guān)系等。 、樣品前處理方法、掃描模式及選擇依據(jù)、數(shù)據(jù)采集及處理方法等。 （二）主要原材料的研究資料應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。 、肉堿和琥珀酰丙酮內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品：一般為經(jīng)過(guò)同位素標(biāo)記的待測(cè)分析物。每種待測(cè)分析物應(yīng)對(duì)應(yīng)其標(biāo)記后的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，如有特殊情況無(wú)法對(duì)應(yīng)其自身標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)說(shuō)明理由，并提交使用替代內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品是否會(huì)對(duì)產(chǎn)品性能產(chǎn)生影響的評(píng)價(jià)資料。應(yīng)提交內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)式、對(duì)應(yīng)的 待測(cè)分析物、賦值資料以及質(zhì)量控制資料（一般包括分子量、化學(xué)純度、同位素純度等）。 、肉堿和琥珀酰丙酮標(biāo)準(zhǔn)品：應(yīng)提供標(biāo)準(zhǔn)品的來(lái)源、選擇依據(jù)、性能指標(biāo)和溯源資料。 ：質(zhì)控品為包含所有待測(cè)分析物的干血斑。質(zhì)控品使用的濾紙應(yīng)明確型號(hào)。應(yīng)至少設(shè)置高、低兩個(gè)濃度水平的質(zhì)控品。質(zhì)控品中的質(zhì)控物質(zhì)應(yīng)與待測(cè)分析物相同，如使用與待測(cè)分析物特性相似的其他物質(zhì)作為其質(zhì)控物，應(yīng)說(shuō)明理由，并提交使用替代質(zhì)控物是否會(huì)對(duì)產(chǎn)品性能產(chǎn)生影響的評(píng)價(jià)資料。應(yīng)提供質(zhì)控品的選擇、制備和賦值資料。 ：應(yīng)提供企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備、定值、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品應(yīng)盡量使用實(shí)際待測(cè)樣本即全血干血斑，如需采用向全血基質(zhì)中模擬添加被測(cè)物的形式制備干血斑（即模擬干血斑），則應(yīng)說(shuō)明理由。企業(yè)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性建立穩(wěn)定的參考品體系，至少應(yīng)包括： 檢測(cè)限參考品應(yīng)建立能夠覆蓋所有待測(cè)分析物的檢測(cè)限參考品。參考品中的待測(cè)分析物濃度應(yīng)為檢測(cè)限濃度，或略高于檢測(cè)限濃度。檢測(cè)限參考品應(yīng)盡量使用全血干血斑，考慮到檢測(cè)限濃度的樣本難以獲得的情況，可采用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品替代待測(cè)分析物 的方式，來(lái)模擬制備檢測(cè)限參考品，例如將檢測(cè)限水平的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入人全血基質(zhì)中制備模擬干血斑等。 如需使用待測(cè)分析物 /內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的替代物質(zhì)制備參考品，應(yīng)提交相應(yīng)的評(píng)估資料。 精密度參考品應(yīng)選擇能夠代表所有待測(cè)分析物結(jié)構(gòu)及性能評(píng)估要求的分析物建立精密度參考品。 精密度參考品應(yīng)設(shè)置多個(gè)具有代表性意義的濃度水平，一般包括正常內(nèi)源性水平、醫(yī)學(xué)決定水平、異常值（異常高值 /異常低值）水平等，各待測(cè)分析物可根據(jù)臨床實(shí)際情況和指標(biāo)設(shè)置的臨床意義，選擇不同的濃度水平設(shè)定參考品，并提交選擇設(shè)定的依據(jù)。 線(xiàn)性參考品應(yīng)建立能夠覆蓋所有待測(cè)分析物的線(xiàn)性參考品。線(xiàn)性參考品應(yīng)選擇多個(gè)梯度濃度水平進(jìn)行設(shè)置并覆蓋整個(gè)線(xiàn)性范圍。如需使用待測(cè)分析物的替代物質(zhì)制備參考品，應(yīng)提交相應(yīng)的評(píng)估資料。 （三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料主要生產(chǎn)工藝主要包括工作液的配制、分裝和包裝等，反應(yīng)體系研究指完成檢測(cè)所涉及到的最佳反應(yīng)條件的選擇確定過(guò)程。主要包括以下內(nèi)容： ，可以圖表方式表示。應(yīng)標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。 、處理的要求和 質(zhì)控品、企業(yè)參考品的干血斑制備的要求，具體可參照相關(guān)管理規(guī)范的內(nèi)容。 （包括各級(jí)工作液、萃取試劑、衍生化試劑、流動(dòng)相等）的選擇、配比、用量的確定和驗(yàn)證過(guò)程。 ，如萃取方法、衍生條件、進(jìn)樣條件、質(zhì)譜條件等。 （四）分析性能評(píng)估資料申請(qǐng)人應(yīng)提交對(duì)試劑盒的全部性能進(jìn)行評(píng)估的資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能評(píng)估的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、人員及數(shù)量、適用儀器、儀器掃描模式、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來(lái)源（如涉及）等。分析性能評(píng)估的實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)文件或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究： ，因通常情況下 不易獲得低于內(nèi)源水平的樣本，申請(qǐng)人可自行設(shè)計(jì)合理的模擬方法進(jìn)行研究。例如，將不同濃度的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品添加至人全血中制備成一系列干血斑，用空白萃取液萃取后進(jìn)行檢測(cè)； 或者用含不同濃度內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的萃取液對(duì)干血斑萃取后進(jìn)行檢測(cè)，等等。其目的是使基質(zhì)中分析物濃度不變，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度遞減，最終通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度來(lái)模擬研究檢測(cè)限。測(cè)量的結(jié)果符合試劑偏差及精密度等要求的最低濃度水平作為檢測(cè)限。 研究過(guò)程中應(yīng)對(duì)各物質(zhì)濃度進(jìn)行精確的確認(rèn)，每一濃度樣本應(yīng)平行檢測(cè)多次。根據(jù)該類(lèi)試劑的預(yù)期用途，每個(gè)待測(cè)分析物的檢測(cè)限應(yīng)等于或低于預(yù)期使用人群的內(nèi)源性水平。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明檢測(cè)限的建立過(guò)程，明確使用的樣本類(lèi)型、試驗(yàn)方法、接受標(biāo)準(zhǔn)和研究結(jié)論等。 的模擬干血斑，分析至少 911 個(gè)濃度水平，每個(gè)水平重復(fù)多次，通過(guò)評(píng)價(jià)一定范圍內(nèi)的線(xiàn)性關(guān)系及準(zhǔn)確度等建立所有待測(cè)分析物的線(xiàn)性范圍。分析物濃度水平覆蓋范圍應(yīng)具臨床意義，至少包含典型的內(nèi)源水平、醫(yī)學(xué)決定水平等。應(yīng)結(jié)合性能指標(biāo)和臨床意義，設(shè)定合理的線(xiàn)性范圍。 ，受系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差共同影響，申 請(qǐng)人應(yīng)綜合考慮偏倚和不精密度的影響，對(duì)產(chǎn)品的準(zhǔn)確度進(jìn)行研究。 正確度建議采用回收實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行正確度的評(píng)價(jià)，同時(shí)可結(jié)合其他合理方法（如方法學(xué)比對(duì)等）進(jìn)行研究?；厥諏?shí)驗(yàn)方法一般為：向全血中添加不同濃度待測(cè)分析物，制備成干血斑，檢測(cè)后計(jì)算回收率，回收率的計(jì)算方法為在含有已知“理論”分析物含量的干血斑提取物中實(shí)際測(cè)得的該分析物含量，以百分比表示?；厥章实慕Y(jié)果應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。干血斑中分析物各濃度水平應(yīng)具臨床意義并盡量覆蓋檢測(cè)范圍。詳細(xì)描述評(píng)價(jià)方法中樣本制備過(guò)程、評(píng)價(jià)方案、試驗(yàn)過(guò)程、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法、 研究結(jié)論等內(nèi)容。 精密度精密度的評(píng)價(jià)方法并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性，具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)指南或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對(duì)本類(lèi)產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求： 對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑本身的影響外，應(yīng)對(duì)不同儀器、操作者、地點(diǎn)、精密度評(píng)價(jià)周期等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。 例如：為期至少 XX 天的連續(xù)檢 測(cè)，每天至少由 X 人完成不少于 X次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi) /批間、日內(nèi) /日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。申請(qǐng)人還應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。 精密度的評(píng)價(jià)應(yīng)選擇多個(gè)濃度水平進(jìn)行，一般來(lái)說(shuō)應(yīng)包含正常內(nèi)源性水平、醫(yī)學(xué)決定水平、異常值（異常高值 /異常低值）水平等，各待測(cè)分析物可根據(jù)臨床實(shí)際情況和指標(biāo)設(shè)置的臨床意義，選擇不同的濃度水平進(jìn)行研究，并提交濃度選擇的依據(jù)。 進(jìn)行研究。特異性研究的樣本可為全 血干血斑或模擬添加被研究物的模擬干血斑。 干擾物質(zhì)干擾物質(zhì)應(yīng)至少包括血紅蛋白、脂類(lèi)、膽紅素等。其他還可能包括潛在患者（如母親）引入的化合物、樣本采集過(guò)程中加入的化合物、血液中存在的其他化合物等，例如常用藥物、麻醉劑、消毒劑、服用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、機(jī)體其他代謝產(chǎn)物等。 建議申請(qǐng)人在干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（即“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。建議至少在內(nèi)源性水平附近濃度對(duì)每種干擾物質(zhì)的干擾影