【正文】 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則 [推薦閱讀 ] 第一篇：氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則 附件 5 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑（串聯(lián)質(zhì)譜法）注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。 本指導(dǎo)原則是針對該類試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。 本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。 本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的 不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。 一、適用范圍本指導(dǎo)原則提及的氨基酸、肉堿（包括游離肉堿和?；鈮A）和琥珀酰丙酮分別是指針對遺傳代謝病的疾病標(biāo)記物。相關(guān) 的 遺 傳 代 謝 病 主 要 包 括 氨 基 酸 代 謝 障 礙（ Disordersofaminoacidmetabolism ）、 脂 肪 酸 氧 化 障 礙（ FattyAcidOxidationdisorders ） 和 有 機 酸 代 謝 障 礙（ Organicacademiadisorders）等。一般來說，氨基酸是氨基酸代謝障礙的疾病標(biāo)記物，游離肉堿與酰基肉堿是脂肪 酸氧化障礙和有機酸代謝障礙的標(biāo)記物，琥珀酰丙酮是酪氨酸血癥 I 型的主要標(biāo)記物。 遺傳代謝病的發(fā)病機理為維持機體正常代謝所必需的酶類、受體和載體等蛋白質(zhì)缺陷，導(dǎo)致機體的生化反應(yīng)和代謝異常，從而引起一系列臨床表現(xiàn)。其臨床表現(xiàn)主要包括神經(jīng)系統(tǒng)損害、代謝紊亂、相關(guān)器官功能異常、生長遲緩、皮膚及毛發(fā)異常、特殊氣味等。我國相對常見的遺傳代謝病如下表所示： 表 1 我國相對常見的遺傳代謝病序號疾病名稱 1 高苯丙氨酸血癥（ HPA） 2 甲基丙二酸血癥（ MMA） 3 原發(fā)性肉堿缺乏癥（ PCD） 4 中鏈?；o酶 A脫氫酶缺乏癥（ MCAD） 5極長鏈?；o酶 A脫氫酶缺乏癥（ VLCAD）6 異戊酸血癥（ IVA） 7 戊二酸血癥 I 型（ GAI） 8 楓糖尿病（ MSUD） 9瓜氨酸血癥 II 型 (希特林蛋白缺乏癥 )（ CITII） 10 瓜氨酸血癥 I 型（ CITⅠ） 11 丙酸血癥（ PA） 12 同型半胱氨酸血癥 I 型（ HCY）遺傳代謝病的臨床檢測方法一般包括實驗室生化檢測、影像學(xué)檢測、負(fù)荷試驗、酶學(xué)檢測、氣相色譜 質(zhì)譜（ GCMS）分析、串聯(lián)質(zhì)譜（ MSMS）分析、基因檢測等。其中串聯(lián)質(zhì)譜法是臨床檢測的常用方法，其優(yōu)點包括：具有高分析效率和高靈敏度，能同時分析多種代謝物， 涵蓋多種遺傳代謝??； 可重復(fù)性好； 操作相對簡單； 干血斑采集和保存方便等。 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測試劑（串聯(lián)質(zhì)譜法）的預(yù)期用途為利用串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，對全血干血斑樣本中氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮的含量進行測量，相關(guān)待測分析物濃度及分析物之間相互比例的異常，可能提示某種遺傳代謝病。其原理是使用含有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的溶液對干血斑進行萃取并采用串聯(lián)質(zhì)譜分析，每種待測分析物對于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)程度與它的濃度成比例，根據(jù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度即可計算分析物的濃度。 該類試劑使用的串聯(lián)質(zhì)譜主 要為三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和四極桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（ Qtrap）。掃描模式主要包括以下四種：前體離子（ precursorion,PI）掃描、中性丟失（ NL）掃描、多反應(yīng)監(jiān)測（ MRM）掃描和產(chǎn)物離子（ production,PI）掃描。前體離子掃描通常用于酰基肉堿的分析檢測，在第二級質(zhì)量分析器中選擇特定質(zhì)荷比的產(chǎn)物離子，測定在第一級質(zhì)量分析器中一定質(zhì)量范圍內(nèi)所有能產(chǎn)生該碎片的前體離子。中性丟失掃描通常用于氨基酸的分析檢測，以恒定的質(zhì)量差異，在一定質(zhì)量范圍內(nèi)同時測定第一級、第二級質(zhì)量分析器中所有的前體離子和產(chǎn)物離子， 檢測能產(chǎn)生特定中性碎片丟失的前體離子。多反應(yīng)監(jiān)測掃描是將第一級質(zhì)譜設(shè)定為用于篩選特定的前體離子，在第二級質(zhì)譜中指定所需的產(chǎn)物離子，同時監(jiān)測前體離子 產(chǎn)物離子。產(chǎn)物離子掃描是在第一級質(zhì)量分析器中選擇特定質(zhì)荷比的前體離子，測定該前體離子在第二級質(zhì)量分析器中，一定質(zhì)量范圍內(nèi)的所產(chǎn)生的特定產(chǎn)物離子。四種掃描模式各有優(yōu)缺點，在實際中應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性選擇適合的掃描模式。 本指導(dǎo)原則適用于進行注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。 本指導(dǎo)原則主要適用于利用串聯(lián)質(zhì)譜法，對干血斑樣本中相關(guān)物質(zhì)進行檢測的試劑，包括采 用衍生法處理后對氨基酸和肉堿進行檢測的試劑和采用非衍生法對氨基酸、琥珀酰丙酮和肉堿進行檢測的試劑。對于遺傳代謝病相關(guān)的其他特征分析物或采用其他檢測方法（如基于抗原抗體反應(yīng)原理方法）、其他樣本類型進行的檢測，有利之處可參照執(zhí)行。本指導(dǎo)原則不適用于對相關(guān)疾病的確證和產(chǎn)前篩查項目。 二、注冊申報資料要求（一）綜述資料綜述資料主要包括臨床適應(yīng)癥背景情況、產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價以及其他內(nèi)容。其中，其他內(nèi)容包括同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況，應(yīng)著重從檢驗方 法及臨床適用范圍等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第 5 號，以下簡稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告 2021 年第 44 號，以下簡稱《公告》）的相關(guān)要求。 另外，建議申請人對以下幾方面內(nèi)容進行著重介紹： 、臨床癥狀、臨床發(fā)病率、檢測方法、治療方法等。 、種類、相應(yīng)的內(nèi)標(biāo) 準(zhǔn)品和質(zhì)控品、經(jīng)臨床驗證的遺傳代謝病與分析物間的對應(yīng)關(guān)系等。 、樣品前處理方法、掃描模式及選擇依據(jù)、數(shù)據(jù)采集及處理方法等。 （二）主要原材料的研究資料應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。 、肉堿和琥珀酰丙酮內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品：一般為經(jīng)過同位素標(biāo)記的待測分析物。每種待測分析物應(yīng)對應(yīng)其標(biāo)記后的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，如有特殊情況無法對應(yīng)其自身標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)說明理由，并提交使用替代內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品是否會對產(chǎn)品性能產(chǎn)生影響的評價資料。應(yīng)提交內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)式、對應(yīng)的 待測分析物、賦值資料以及質(zhì)量控制資料（一般包括分子量、化學(xué)純度、同位素純度等）。 、肉堿和琥珀酰丙酮標(biāo)準(zhǔn)品：應(yīng)提供標(biāo)準(zhǔn)品的來源、選擇依據(jù)、性能指標(biāo)和溯源資料。 ：質(zhì)控品為包含所有待測分析物的干血斑。質(zhì)控品使用的濾紙應(yīng)明確型號。應(yīng)至少設(shè)置高、低兩個濃度水平的質(zhì)控品。質(zhì)控品中的質(zhì)控物質(zhì)應(yīng)與待測分析物相同，如使用與待測分析物特性相似的其他物質(zhì)作為其質(zhì)控物，應(yīng)說明理由，并提交使用替代質(zhì)控物是否會對產(chǎn)品性能產(chǎn)生影響的評價資料。應(yīng)提供質(zhì)控品的選擇、制備和賦值資料。 ：應(yīng)提供企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備、定值、統(tǒng)計學(xué)分析及相關(guān)的實驗驗證資料。企業(yè)參考品應(yīng)盡量使用實際待測樣本即全血干血斑，如需采用向全血基質(zhì)中模擬添加被測物的形式制備干血斑（即模擬干血斑），則應(yīng)說明理由。企業(yè)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性建立穩(wěn)定的參考品體系，至少應(yīng)包括： 檢測限參考品應(yīng)建立能夠覆蓋所有待測分析物的檢測限參考品。參考品中的待測分析物濃度應(yīng)為檢測限濃度，或略高于檢測限濃度。檢測限參考品應(yīng)盡量使用全血干血斑，考慮到檢測限濃度的樣本難以獲得的情況，可采用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品替代待測分析物 的方式，來模擬制備檢測限參考品，例如將檢測限水平的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入人全血基質(zhì)中制備模擬干血斑等。 如需使用待測分析物 /內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的替代物質(zhì)制備參考品，應(yīng)提交相應(yīng)的評估資料。 精密度參考品應(yīng)選擇能夠代表所有待測分析物結(jié)構(gòu)及性能評估要求的分析物建立精密度參考品。 精密度參考品應(yīng)設(shè)置多個具有代表性意義的濃度水平，一般包括正常內(nèi)源性水平、醫(yī)學(xué)決定水平、異常值（異常高值 /異常低值）水平等，各待測分析物可根據(jù)臨床實際情況和指標(biāo)設(shè)置的臨床意義，選擇不同的濃度水平設(shè)定參考品，并提交選擇設(shè)定的依據(jù)。 線性參考品應(yīng)建立能夠覆蓋所有待測分析物的線性參考品。線性參考品應(yīng)選擇多個梯度濃度水平進行設(shè)置并覆蓋整個線性范圍。如需使用待測分析物的替代物質(zhì)制備參考品，應(yīng)提交相應(yīng)的評估資料。 （三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料主要生產(chǎn)工藝主要包括工作液的配制、分裝和包裝等，反應(yīng)體系研究指完成檢測所涉及到的最佳反應(yīng)條件的選擇確定過程。主要包括以下內(nèi)容： ，可以圖表方式表示。應(yīng)標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。 、處理的要求和 質(zhì)控品、企業(yè)參考品的干血斑制備的要求，具體可參照相關(guān)管理規(guī)范的內(nèi)容。 （包括各級工作液、萃取試劑、衍生化試劑、流動相等）的選擇、配比、用量的確定和驗證過程。 ，如萃取方法、衍生條件、進樣條件、質(zhì)譜條件等。 （四）分析性能評估資料申請人應(yīng)提交對試劑盒的全部性能進行評估的資料，對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括研究目的、實驗設(shè)計、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能評估的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點（實驗室）、人員及數(shù)量、適用儀器、儀器掃描模式、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源（如涉及）等。分析性能評估的實驗方法可以參考相關(guān)文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進行。建議著重對以下分析性能進行研究： ，因通常情況下 不易獲得低于內(nèi)源水平的樣本，申請人可自行設(shè)計合理的模擬方法進行研究。例如，將不同濃度的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品添加至人全血中制備成一系列干血斑，用空白萃取液萃取后進行檢測； 或者用含不同濃度內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的萃取液對干血斑萃取后進行檢測，等等。其目的是使基質(zhì)中分析物濃度不變，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度遞減，最終通過檢測內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度來模擬研究檢測限。測量的結(jié)果符合試劑偏差及精密度等要求的最低濃度水平作為檢測限。 研究過程中應(yīng)對各物質(zhì)濃度進行精確的確認(rèn)，每一濃度樣本應(yīng)平行檢測多次。根據(jù)該類試劑的預(yù)期用途，每個待測分析物的檢測限應(yīng)等于或低于預(yù)期使用人群的內(nèi)源性水平。應(yīng)詳細(xì)說明檢測限的建立過程，明確使用的樣本類型、試驗方法、接受標(biāo)準(zhǔn)和研究結(jié)論等。 的模擬干血斑，分析至少 911 個濃度水平，每個水平重復(fù)多次，通過評價一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及準(zhǔn)確度等建立所有待測分析物的線性范圍。分析物濃度水平覆蓋范圍應(yīng)具臨床意義，至少包含典型的內(nèi)源水平、醫(yī)學(xué)決定水平等。應(yīng)結(jié)合性能指標(biāo)和臨床意義，設(shè)定合理的線性范圍。 ，受系統(tǒng)誤差和隨機誤差共同影響，申 請人應(yīng)綜合考慮偏倚和不精密度的影響，對產(chǎn)品的準(zhǔn)確度進行研究。 正確度建議采用回收實驗方法進行正確度的評價，同時可結(jié)合其他合理方法（如方法學(xué)比對等）進行研究。回收實驗方法一般為：向全血中添加不同濃度待測分析物，制備成干血斑，檢測后計算回收率，回收率的計算方法為在含有已知“理論”分析物含量的干血斑提取物中實際測得的該分析物含量，以百分比表示?；厥章实慕Y(jié)果應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。干血斑中分析物各濃度水平應(yīng)具臨床意義并盡量覆蓋檢測范圍。詳細(xì)描述評價方法中樣本制備過程、評價方案、試驗過程、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法、 研究結(jié)論等內(nèi)容。 精密度精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或研究習(xí)慣進行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性，具體實驗方法可以參考相關(guān)指南或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進行。應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求： 對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑本身的影響外，應(yīng)對不同儀器、操作者、地點、精密度評價周期等要素進行相關(guān)的驗證。 例如：為期至少 XX 天的連續(xù)檢 測，每天至少由 X 人完成不少于 X次的完整檢測，從而對批內(nèi) /批間、日內(nèi) /日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。申請人還應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。 精密度的評價應(yīng)選擇多個濃度水平進行，一般來說應(yīng)包含正常內(nèi)源性水平、醫(yī)學(xué)決定水平、異常值（異常高值 /異常低值）水平等，各待測分析物可根據(jù)臨床實際情況和指標(biāo)設(shè)置的臨床意義，選擇不同的濃度水平進行研究，并提交濃度選擇的依據(jù)。 進行研究。特異性研究的樣本可為全 血干血斑或模擬添加被研究物的模擬干血斑。 干擾物質(zhì)干擾物質(zhì)應(yīng)至少包括血紅蛋白、脂類、膽紅素等。其他還可能包括潛在患者（如母親）引入的化合物、樣本采集過程中加入的化合物、血液中存在的其他化合物等，例如常用藥物、麻醉劑、消毒劑、服用的營養(yǎng)物質(zhì)、機體其他代謝產(chǎn)物等。 建議申請人在干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（即“最差條件”）條件下進行評價。建議至少在內(nèi)源性水平附近濃度對每種干擾物質(zhì)的干擾影