分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用-文庫(kù)吧
2025-01-15 20:14 本頁(yè)面
【正文】 不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。l通過(guò)對(duì) 54個(gè)植物種核 DNA和 28個(gè)植物種細(xì)胞器DNA SSR(14bp)的搜索 ,發(fā)現(xiàn)：l (AT)ｎ 最豐富 ,然后依次是 : (A)n、 (T)n、 (AG)n、(CT)n、 (AAT)n、 (ATT)n、 (AAC)n、 (GTT)n、 (AGC)n、 (GCT)n、 (AAG)n、 (CTT) n、 (AATT)n、 (TTAA)n、(AAAT)n、 (ATTT)n及 (AC)n、 (GT)n。l同一類(lèi)內(nèi)堿基種類(lèi)不同的 SSR,豐度差別很大。SSR的分布特點(diǎn)SSR的功能長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為 SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒(méi)有明確的生理功能。但隨著研究深入，證明并非如此。SSR的主要功能 : 216。 編碼氨基酸；216。 染色體末端的 SSR，有保護(hù) DNA完整性、避免降解、融合及丟失的功能；216。 提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率；216。 基因重組的熱點(diǎn)，是基因變異的來(lái)源；216。 部分 SSR可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物或活化染色體v 兩端序列多是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò) PCR將其間微衛(wèi)星序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳技術(shù)獲得長(zhǎng)度多態(tài)性。v 不同材料重復(fù)次數(shù)的不同 ， 導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性。SSR分析SSR分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建探針制備 預(yù)雜交 帶有 SSR克隆的選擇測(cè)序引物設(shè)計(jì)檢測(cè)其它方法 :ESTSSR、相關(guān)種間 SSR......Crossspecies SSRTaxonomic Transferability Polymorphism Divergence % (N) % (N)Same subgenus (521) (299)Same genus (1800) (773)Same alliance (403) (141)Same family (1683) (363)SSR的操作PCR反應(yīng)：DNA（ 20ng/181。l） 4181。lPrimer（ 1mM） 10Buffer Mg2+（ 25mM） Taq酶（ 5U/181。l） dNTP（ 25mM） 加水至 20181。l混合后，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ：Step1 95℃ 2分鐘Step2 95℃ 30秒Step3 56℃ 30秒Step4 72℃ 60秒Step5 GOTOStep231循環(huán)注： SSR引物退火溫度在 5265℃ 不等。SSR的特點(diǎn)：l 兩側(cè)順序保守，在同種間多相同；l 數(shù)量豐富，在整個(gè)基因組均勻隨機(jī)分布；l 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；l 多數(shù) SSR增減重復(fù)序列頻率高，在品種間具廣泛位點(diǎn)變異；l 共顯性標(biāo)記，可鑒別雜合子和純合子；l 僅需微量組織，適合 PCR分析半自動(dòng)化v 相對(duì)的物種專(zhuān)一性；v 由于開(kāi)發(fā)時(shí)需針對(duì)每個(gè)座位的微衛(wèi)星序列，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，需建立基因文庫(kù)、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過(guò)程，開(kāi)發(fā)困難，費(fèi)用較高，耗時(shí)長(zhǎng)；v 實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)；v 不同引物退火溫度不同，需要探索。不足：SSR的檢測(cè)u瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）u聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)u一般采用銀染、熒光檢測(cè)。銀染檢測(cè)程序脫色 ：加 1升 10%HAC液，脫色 20分鐘沖洗 ：用重蒸水沖洗膠板 2次，每次 5分鐘染色 ：加染色液 (1%AgNO3， %甲醛 )30分鐘沖洗 ：用重蒸水沖洗膠板不超過(guò) 5秒鐘；顯影 ：預(yù)冷顯影液（ 30g/LNaCO3， %甲醛， ）， 輕搖到帶紋出現(xiàn)；定影 ：在固定 /停止液并輕搖 35分鐘；沖洗 ：用重蒸水沖洗 2次，每次 2分鐘；干膠 ：室溫下自然干燥過(guò)夜。AFLP（ Amplified Fragment Length Polymorphism)n 原理：n 基于 RFLP技術(shù)和 PCR技術(shù)的結(jié)合 DNAMseI MseI MseI EcoRI EcoRI EcoRIn MseI MseI片段環(huán)化，不利小片段擴(kuò)增；n EcoRI EcoRI 引物的退火溫度高；n MseI EcoRI 片段優(yōu)先擴(kuò)增酶切連接接頭序列n MseⅠ 接頭、 PstⅠ 分別為：n MseⅠ ： n 5’GACGATGAGTCCTGAG3’ n 3’TACTCAGGACTCAT5’n PstⅠ ： n 5’CTCGTAGACTGCGTACC3’n 3’CTGACGCATGGTTAA5’n EcoRⅠ ：n 5’CTCGTAGACTGCGTACC3’n 3’CTGACGCATGGTTAA5’ M00:539。GATGAGTCCTGAGTAA339。；P00:539。 GACTGCGTACCAATTC339。E00:539。GACTGCGTACCAATTC339。MseIprimers +3: 539。GATGAGTCCTGAGTAANNN3‘EcoRIprimers +3: 539。GACTGCGTACCAATTCNNN3‘PstIprimers +3: 539。GACTGCGTACATCGAGNNN3‘ AFLP技術(shù)的特點(diǎn)（ 1）由于內(nèi)切酶及選擇性堿基組合數(shù)和種類(lèi)很多，產(chǎn)生標(biāo)記數(shù)無(wú)限，可覆蓋整個(gè)基因組。（ 2）多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它分子標(biāo)記，一般可檢測(cè)到 50100個(gè) AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠在遺傳關(guān)系十分相近的材料產(chǎn)生多態(tài)性，被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)。（ 3） AFLP分析由于擴(kuò)增片段較短（ 30700bp)， 分辨率高。（ 4） AFLP分析用樣量少（ ?g DNA）， 而且對(duì)模板濃度的變化不敏感。（ 5）由于特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，因而假陽(yáng)性低，可靠性高。（ 6）引物在不同物種間是通用的，可用于沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種。（ 7）銀染技術(shù)具有快速、方便的特點(diǎn)，在 12天內(nèi)可以得到指紋。AFLP操作具體包括三個(gè)步驟：1.酶切 連接；2.PCR擴(kuò)增，使目的序列擴(kuò)增到 ～ 1μg；3.電泳分離（利用聚丙烯酰胺凝膠）。對(duì)于基因組較大的物種，需要進(jìn)行兩步擴(kuò)增 —預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。AFLP操作步驟：模板 DNA的酶切與連接DNA（ 200ng/181。l） MseⅠ 3單位 PstⅠ 3單位MseⅠ 接頭（ 50pmol/181。l） PstⅠ 接頭（ 5pmol/181。l） 10NEBBuffer 100BSA ATP（ 10mM） T4連接酶（ 3U/181。l） 加水至 25181。l， 37℃ 酶切 連接 46小時(shí)，或過(guò)夜 。 AFLP實(shí)驗(yàn)程序DNA片段的預(yù)擴(kuò)增取 ，加入 18181。l如下混合液：MseⅠ 引物（ M00， 50ng/181。l） PstⅠ 引物（ P00， 50ng/181。l） 10PCRBuffer Mg2+（ 25mM） Taq酶（ 5U/181。l） dNTP（ 25mM） 加 ddH2O至 20181。l 混合后，在如下 PCR條件下擴(kuò)增：Step1 95℃ 2分鐘Step2 95℃ 30秒Step3 56℃ 30秒Step4 72℃ 60秒Step5 GOTOStep231cycles1
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