分子標記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用-全文預(yù)覽
【正文】 thdistancein“route植物基因組遺傳作圖構(gòu)建遺傳圖譜 （ molecular marker linkage map）以具有遺傳多型性的分子標記為 “ 路標 ”PolymorphictwohybridspectrometrycSSR、 cSNP——— 從 EST中開發(fā) SSR、 SNPn 目前某些植物全序列的測定及 EST數(shù)據(jù)庫的開發(fā)，為 SSR、 SNP的開發(fā)開辟了 新的途徑 。EST常用 UPGMAn 分析軟件： （ Rholf， 1998）QTL分析l ‘A’ Homozygote for the allele from A parentl ‘B’ Homozygote for the allele from B parentl ‘H’ Heterozygote carrying both alelles A and Bl ‘C’ Either BB or AB genotypel ‘D’ Either AA or AB genotypel ‘’ Missing data for the individual at this locusdata type F2 intercross20 5 1*locus1 BBBHHAAABBBHHHAABA*locus2 ABABHABHABABABHAH*locus3 ABBAHHHBHABHABHBBHHLocus3 may be misscored in individual 12!*locus4 ABHHABAAAHABABHABHH*locus5 ABHABHAAABHABHAHHHB*trait1 EST (Expressed Sequence Tags)SNP（ single nucleotide polymophism）cSSR、 cSNPDNA微陣列（ Microarray）蛋白質(zhì)組學(xué)n ．．．?。滦头肿訕擞沶 EST（ Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested） clustering相似系數(shù)(Jaccard．同位素、熒光標記分辨率較高，但價格昂貴，操作不方便；銀染方法方便快捷，掌握好各個環(huán)節(jié)，同樣可以達到很好的效果。5． EcoRⅠ 受甲基化胞嘧啶的影響較小，而PstⅠ 對富含的甲基化胞嘧啶十分敏感，因而 PstⅠ MseⅠ 檢測的多為表達區(qū)域，而EcoRⅠ MseⅠ 檢測位點聚集在甲基化較高的重復(fù)序列區(qū)域。在 ，且不能有降解。5分鐘AFLP的 檢測216。Step10 3030秒Step6 95℃ Step230秒（ ℃ /cycle）Step3 65℃ ddH2O Taq酶（ 5U/181。l） l） Step6dNTP（ 25mM） 10PCR引物（ M00， 50ng/181。 AFLP實驗程序DNA片段的預(yù)擴增取 ，加入 18181。 10NEBl） 3單位MseⅠ l） MseⅠ 3單位 PCR擴增，使目的序列擴增到 ～ 1μg；3.（ 6）引物在不同物種間是通用的，可用于沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種。（ 4） AFLP分析用樣量少（ GACTGCGTACCAATTCNNN3‘PstIprimers +3: 539。E00:539。DNAMseI MseI MseI EcoRI EcoRI EcoRIn MseI MseI片段環(huán)化，不利小片段擴增；n EcoRI EcoRI 引物的退火溫度高；n MseI EcoRI 片段優(yōu)先擴增酶切連接接頭序列n MseⅠ 接頭、 PstⅠ 分別為：n MseⅠ ： n 5’GACGATGAGTCCTGAG3’ n 3’TACTCAGGACTCAT5’n PstⅠ ： n 5’CTCGTAGACTGCGTACC3’n 3’CTGACGCATGGTTAA5’n EcoRⅠ ：n 5’CTCGTAGACTGCGTACC3’n 3’CTGACGCATGGTTAA5’ M00:539。銀染檢測程序脫色 ：加 1升 10%HAC液，脫色 20分鐘沖洗 ：用重蒸水沖洗膠板 2次，每次 5分鐘染色 ：加染色液 (1%AgNO3， %甲醛 )30分鐘沖洗 ：用重蒸水沖洗膠板不超過 5秒鐘；顯影 ：預(yù)冷顯影液（ 30g/LNaCO3， %甲醛， ）， 輕搖到帶紋出現(xiàn)；定影 ：在固定 /停止液并輕搖 35分鐘；沖洗 ：用重蒸水沖洗 2次，每次 2分鐘；干膠 ：室溫下自然干燥過夜?！?lPrimer（ 1mM） 10Buffer Mg2+（ 25mM） Taq酶（ 5U/181。SSR分析SSR分子標記的創(chuàng)制基因組文庫的構(gòu)建探針制備 預(yù)雜交 帶有 SSR克隆的選擇測序引物設(shè)計檢測其它方法 : 提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率；216。但隨著研究深入，證明并非如此。l不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。n 具有更高的可重復(fù)性n 共顯性微衛(wèi)星標記 (SSR)l真核生物基因組普遍存在，呈隨機分布 ,大約每隔 1050kb就存在一個 SSR.l哺乳動物中約為植物的 56倍 。 （ CaetanoAnolles等， 1990）APPCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)l引物較長（ 10～ 50bp） ；l引物濃度較高；l引物長度不定，并且常常來自為其它目的而設(shè)計的引物（如 M13通用測序引物）。PCR擴 增：主要特點? 無需雜交，設(shè)計引物也無須知道序列信息；? DNA需要量少，引物便宜，成本較低；? 技術(shù)簡便，操作方便、快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。Step272℃ 95℃ dNTP（ 25mM） 加水至 20181。 339。 339。 539。n 2uln 5ul置 70℃ 超低溫冰箱中曝光 10天左右?！?放射自顯影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上 ,n 雜交：預(yù)雜交液中加入標記好的 marker和探針，放入雜交膜浸勻。印跡n 沖洗：以 2SSCn 變性： 電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小n 酶切： 35ug—AmplifiedAPPCR)n SSRAmplifiedFragment（ 3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個基因組；（ 4）表現(xiàn)為 “中性 ”，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖；（ 5）許多分子標記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。n 特點：直觀、快速而經(jīng)濟，但變異十分有限，當染色體數(shù)目形態(tài)相似時難以分辨。n 特點：直觀簡單n 從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達、調(diào)控、個體發(fā)育等環(huán)節(jié)，表型差異有時難以反映基因型差異。n 如穗形、芒長、穗長、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。n 隨著分帶、細胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。分子標記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標記，一般特點：（ 1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達與否的限制；（ 2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異； Restrictionn RAPD—Random(DAF,Repeatn AFLPPolymorphismRFLPn 原理： n 染色： EtBr染色 20分鐘 NaOH， 進行 Southern封好后置 65℃ 溫箱中振蕩 5－ 6小時。振蕩洗脫兩次（ 15min/次） ， 吸干包好。再放上另一張增感屏，裝人暗袋，并用夾板夾好。ng變性 DNA[α32P]dCTPPolymerase Chain ReactionPCR339。Target DNA sequenceGCTCGC AGTACTTCATGACGAGC
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