【正文】 的過程和機(jī)理對(duì)蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究，對(duì)保留蛋白質(zhì)活性，維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和包涵體蛋白質(zhì)折疊復(fù)性都具有重要的意義(21)。早在上世紀(jì)30年代，我國(guó)生化界先驅(qū)吳憲教授就對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用進(jìn)行了闡釋（8），30年后，Anfinsen通過對(duì)核糖核酸酶A的經(jīng)典研究表明去折疊的蛋白質(zhì)在體外可以自發(fā)的進(jìn)行再折疊，僅僅是序列本身已經(jīng)包括了蛋白質(zhì)正確折疊的所有信息（9,10），并提出蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)假說，為此Anfinsen獲得1972年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。這一理論有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：1蛋白質(zhì)的狀態(tài)處于去折疊和天然構(gòu)象的平衡中；2 天 然構(gòu)象的蛋白質(zhì)處于熱力學(xué)最低的能量狀態(tài)。盡管蛋白質(zhì)的氨基酸序列在蛋白質(zhì)的正確折疊中起著核心的作用，各種各樣的因素，包括信號(hào)序列，輔助因子，分子伴 侶，環(huán)境條件，均會(huì)影響蛋白質(zhì)的折疊，新生蛋白質(zhì)折疊并組裝成有功能的蛋白質(zhì)，并非都是自發(fā)的，在多數(shù)情況下是需要其它蛋白質(zhì)的幫助，已經(jīng)鑒定了許多參與 蛋白質(zhì)折疊的折疊酶和分子伴侶（3,16,86）， 蛋白質(zhì)“自發(fā)折疊”的經(jīng)典概念發(fā)生了轉(zhuǎn)變和更新，但這并不與折疊的熱力學(xué)假說相矛盾，而是在動(dòng)力學(xué)上完善了熱力學(xué)觀點(diǎn)。在蛋白質(zhì)的折疊過程中，有許多作用 力參與，包括一些構(gòu)象的空間阻礙，范德華力，氫鍵的相互作用，疏水效應(yīng)，離子相互作用，多肽和周圍溶劑相互作用產(chǎn)生的熵驅(qū)動(dòng)的折疊（12,52），但對(duì)于蛋白質(zhì)獲得天然結(jié)構(gòu)這一復(fù)雜過程的特異性，我們還知之甚少，許多實(shí)驗(yàn)和理論的工作都在加深我們對(duì)折疊的認(rèn)識(shí)，但是問題仍然沒有解決。在折疊的機(jī)制研究上早期的理論認(rèn)為，折疊是從變性狀態(tài)通過中間狀態(tài)到天然狀態(tài)的一個(gè)逐步的過程，并對(duì)折疊中間體進(jìn)行了深入研究，認(rèn)為折疊是在熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)下按單一的途徑進(jìn)行的。后來的研究表明折疊過程存在實(shí)驗(yàn)可測(cè)的多種中間體，折疊通過有限的路徑進(jìn)行。新的理論強(qiáng)調(diào)在折疊的初始階段存在多樣性，蛋白質(zhì)通過許多的途徑進(jìn)入折疊漏斗（folding funnel），從而折疊在整體上被描述成一個(gè)漏斗樣的圖像，折疊的動(dòng)力學(xué)過程被認(rèn)為是部分折疊的蛋白質(zhì)整體上的進(jìn)行性裝配，并且伴隨有自由能和熵的變化，蛋白質(zhì)最終尋找到自己的正確的折疊結(jié)構(gòu)，這一理論稱為能量圖景（energy landscape），如圖3所示，漏斗下方的凹凸反映蛋白質(zhì)構(gòu)象瞬間進(jìn)入局部自由能最小區(qū)域(13,14)。圖 3：能量圖景（The energy landscape）的示意圖，高度代表能量尺度，寬度代表構(gòu)象尺度，在漏斗（funnel）的下方存在別的低能量狀態(tài)，共存的不同能量狀態(tài)的蛋白質(zhì)種類也降到最小(14)。這一理論認(rèn)為結(jié)構(gòu)同源的蛋白質(zhì)可以通過不同的折疊途徑形成相似的天然構(gòu)象，人酸性成纖維生長(zhǎng)因子（hFGF1）和蠑螈酸性成纖維生長(zhǎng)因子（nFGF1）氨基酸序列具有約80%同源性，并且具有結(jié)構(gòu)同源性（12個(gè)β折疊反向平行排列形成β折疊桶），在鹽酸胍誘導(dǎo)去折疊的過程中，hFGF1可以監(jiān)測(cè)到具有熔球體樣的折疊中間體，而nFGF1經(jīng)由兩態(tài)（天然狀態(tài)到變性狀態(tài)）去折疊，沒有檢測(cè)到中間體的存在，折疊的動(dòng)力學(xué)研究也表明兩種蛋白采用不同的折疊機(jī)制（38）。對(duì)于同一蛋白質(zhì)，采用的滲透壓調(diào)節(jié)劑（osmolytes）不同，蛋白質(zhì)折疊的途徑也不相同，說明不同的滲透壓調(diào)節(jié)劑對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定效應(yīng)不同（11）。這兩個(gè)例子都說明折疊機(jī)制的復(fù)雜性，也與上面所介紹的理論相吻合。 包涵體的分離和溶解分 離包涵體的第一步是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行最大限度的溶解，將幾種細(xì)胞破碎技術(shù)相結(jié)合，如聯(lián)合使用溶菌酶處理，高壓勻漿細(xì)胞破碎和含表面活性劑的高鹽溶液處理，可以使 膜碎片和細(xì)胞壁碎片最大限度的分解。細(xì)胞破碎后，通過離心的方法可以很方便的回收包涵體，再用洗滌液（通常含有低濃度的變性劑，表面活性劑，還原劑，EDTA）對(duì)包涵體進(jìn)行清洗，就可以得到較純的包涵體（4，74）。通常要選用強(qiáng)的變性劑使蛋白質(zhì)完全變性溶解，如6 M的鹽酸胍和8 M 的尿素，蛋白質(zhì)濃度多采用110mg/ml（22）。由于鹽酸胍溶解包涵體蛋白質(zhì)能力比尿素強(qiáng)，而且尿素中的異氰酸酯可以使自由氨基氨甲?；ㄟ@種作用在堿性條件下表現(xiàn)的更強(qiáng)），所以常常首選鹽酸胍作為解離劑。對(duì)含有分子間二硫鍵或非天然二硫鍵的包涵體蛋白質(zhì)，在溶解過程中需要加入還原劑，如二硫蘇糖醇，β巰基乙醇，還原型谷胱甘肽，加入螯和劑，如EDTA，可以防止金屬催化的半胱氨酸氧化。除此之外，改變pH和使用表面活性劑也被用于溶解包涵體蛋白質(zhì)（22），相對(duì)而言，這兩種方法的應(yīng)用較少，而且只有具有正確二硫鍵的包涵體蛋白質(zhì)才可以用表面活性劑進(jìn)行溶解，否則可同時(shí)形成正確的和非正確的二硫鍵，表明用尿素、鹽酸胍變性和用表面活性劑變性對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)有不同的影響，Tsumoto在這方面做了詳細(xì)的論述（25）。Panda等在高pH 條件下使用低濃度的尿素溶解包涵體蛋白質(zhì)，用于重組牛生長(zhǎng)激素、重組人生長(zhǎng)激素和獼猴透明帶糖蛋白的變復(fù)性，認(rèn)為在變性時(shí)蛋白質(zhì)所保留的天然二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于蛋白的折疊，減少蛋白質(zhì)的聚集。但采用的高pH條件可以使氨基酸殘基發(fā)生化學(xué)修飾，還需要更多的驗(yàn)證（73）。以上變性的方法屬于化學(xué)變性，使用高的靜力壓提供了蛋白質(zhì)變性的另外一種物理變性方法，靜力壓促進(jìn)蛋白質(zhì)變性解離，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在變性條件下，系統(tǒng)整體趨向于更小的體積。聯(lián)合使用高壓和低濃度的變性劑已用于包涵體蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體的變性，是一種有前景的變性方法（31,83)。 溶解后包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性蛋白質(zhì)分子變性后，通過改變折疊的條件使蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然構(gòu)象的過程，稱為復(fù)性。已經(jīng)發(fā)展了很多的方法用于包涵體的折疊復(fù)性，但是這些方法的結(jié)果并不可預(yù)測(cè)，每一種方法都需要對(duì)各種實(shí)驗(yàn)條件，如變性劑濃度、pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、添加劑的濃度，進(jìn)行優(yōu)化選擇。通常包涵體在變性溶解后具有高的純度，可以直接進(jìn)行復(fù)性。但由于包涵體還含有其它的細(xì)胞成分，如膜蛋白、磷脂、核酸，可能影響蛋白質(zhì)的復(fù)性（53,54），為了進(jìn)一步提高純度，有些研究工作在包涵體變性后先進(jìn)行蛋白的純化，如親和層析（47,55,57,60,63,64,65, 68）、離子交換層析（47,56）、凝膠過濾層析、反相層析（62），再進(jìn)行變性蛋白質(zhì)的復(fù)性，層析在變性條件下應(yīng)用為這一策略提供了技術(shù)支持。為了控制折疊、錯(cuò)誤折疊和聚集的速率，一種方法是降低變性劑的濃度，降低的速度和操作的時(shí)間都決定折疊的效率。另一種方法就是加入添加劑來減少聚集，促進(jìn)折疊，如L精氨酸，鹽，有機(jī)溶劑，一些表面活性劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑（osmolytes），硫代甜菜堿類物質(zhì)（NDSBs），這些物質(zhì)或穩(wěn)定蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，或使部分折疊的中間體不穩(wěn)定，表2 列出了這些化合物和它們可能的作用機(jī)制，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)的折疊中起著重要的作用，已得到廣泛的應(yīng)用（13,25,32,4,74），但對(duì)于其中的好些化合物參與折疊的作用機(jī)制我們還了解不多。表 2 增加蛋白質(zhì)折疊的添加劑添加劑可能的作用機(jī)制甘油對(duì)蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/增加黏度L精氨酸兩親分子/滲壓劑甘氨酰甜菜堿/山梨糖醇對(duì)蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用阿拉伯聚糖增加黏度木糖醇增加黏度乙醇調(diào)節(jié)極性DMSO調(diào)節(jié)極性兩性離子表面活性劑（Zwitterionic detergents）保護(hù)非極性表面Triton X100保護(hù)非極性表面硫代甜菜堿類物質(zhì)（NDSBs）保護(hù)非極性表面蔗糖/海藻糖對(duì)蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/增加黏度N氧化三甲胺（TMAO）對(duì)蛋白質(zhì)具有優(yōu)先的水合作用/滲壓劑三氟乙醇（TFE）促進(jìn)二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成低濃度鹽酸胍使部分折疊的中間體不穩(wěn)定/增加天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的溶解性低濃度尿素使部分折疊的中間體不穩(wěn)定/增加天然構(gòu)象蛋白質(zhì)的溶解性配體穩(wěn)定天然結(jié)構(gòu)狀態(tài)聚乙二醇保護(hù)熔球體（molten globule）/增加黏度在折疊過程中另一個(gè)關(guān)鍵的問題是正確二硫鍵的形成，一旦形成了錯(cuò)誤的二硫鍵，就不能再折疊形成正確的結(jié)構(gòu)，所以在折疊時(shí)不僅要氧化促進(jìn)二硫鍵的形成，還要加入還原劑促進(jìn)二硫鍵改組（disulfidebond reshuffling），使蛋白質(zhì)最終折疊成正確的結(jié)構(gòu)。常用的方法有：1 使用金屬催化的空氣氧化，并添加還原劑促進(jìn)二硫鍵改組，由于氧在蛋白質(zhì)溶液中溶解性低，這種方法的效率較低，改用攪拌促進(jìn)氧的質(zhì)量傳輸，又會(huì)造成蛋白質(zhì)的聚集；2 使用小分子還原型和氧化型的巰基試劑對(duì)，包括還原型和氧化型的谷胱甘肽（GSH/GSSG）、半胱氨酸和胱氨酸（cysteine/cystine）、半胱胺和胱胺（cysteamine/cystamine）、二硫蘇糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTT/GSSG），二流赤蘚糖醇和氧化型谷胱甘肽（DTE/GSSG），這一方法是目前常用的方法，通常使用的巰基試劑總濃度為515mM，還原劑和氧化劑的比為5:1―1:1（4,74）。3 在復(fù)性前將巰基保護(hù)起來，有兩種方法可以選擇，一是通過谷胱甘肽和蛋白的半胱氨酸殘基形成二硫鍵來保護(hù)巰基，二是進(jìn)行半胱氨酸磺酸化，從而減少?gòu)?fù)性過程中不正確的二硫鍵的形成，復(fù)性后再加入還原劑使形成正確二硫鍵。人組織纖溶酶原激活劑（tPA）含有35個(gè)半胱氨酸殘基，可形成17對(duì)二硫鍵，即使在天然狀態(tài)下也只具有低的溶解性，進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)這兩種巰基保護(hù)方法都被用于該蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性，由于在蛋白質(zhì)的巰基上引入了帶電荷的殘基，增加了變性蛋白和部分折疊中間體的溶解性，減少了復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的聚集，可獲得較高的復(fù)性效率（25,32,33）。人絨毛膜促性腺激素β亞基（hCGβ）含有12個(gè)半胱氨酸殘基，如果不進(jìn)行巰基保護(hù)，在折疊復(fù)性中會(huì)形成寡聚體和大量沉淀，變性蛋白質(zhì)磺酸化后再折疊復(fù)性可形成幾乎100%單體蛋白，同時(shí)提高了得率和純度（37）。此外，在前胰島素的折疊復(fù)性中也應(yīng)用了磺酸化保護(hù)（44,47,48），所以這一方法在進(jìn)行復(fù)雜蛋白的變復(fù)性時(shí)可以采用。 稀釋復(fù)性和透析復(fù)性用折疊緩沖液快速稀釋溶解的包涵體蛋白質(zhì)溶液，達(dá)到降低變性劑濃度的目的，使去折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行再折疊，就是稀釋復(fù)性。為了很快避開低溶解性變性劑區(qū)（如圖2中c區(qū) 段所示），減少蛋白的聚集，在進(jìn)行稀釋時(shí)一定要快速。折疊進(jìn)行時(shí)的蛋白質(zhì)濃度是體外折疊成功的關(guān)鍵，理想的情況是希望折疊在高濃度的條件下進(jìn)行，但是在高 濃度的條件下變性劑的稀釋常常造成去折疊和部分折疊蛋白質(zhì)的聚集。對(duì)于折疊，是一個(gè)一級(jí)的反應(yīng)過程，而聚集是一個(gè)高級(jí)的反應(yīng)過程，依賴蛋白質(zhì)的濃度，所以 需要小心的選擇蛋白質(zhì)的濃度，一般的蛋白質(zhì)的終濃度保持在2050μg/mL。透析的方法不顯著的改變?nèi)芤旱捏w積，但時(shí)間較長(zhǎng)，而且易形成蛋白質(zhì)沉淀，所以透析起始的蛋白質(zhì)濃度非常關(guān)鍵，而且僅對(duì)一些蛋白質(zhì)有效。變性劑濃度的降低也可以分階段的進(jìn)行，或先經(jīng)過稀釋，再透析去除剩余的變性劑，由于變性劑的濃度在開始時(shí)先降到一定的水平，增加了部分折疊中間體的溶解性，常?？梢蕴岣哒郫B的效率，但是必須通過實(shí)驗(yàn)選擇在不同階段使用的變性劑濃度，避開圖2 所示的c區(qū)段。除了要考慮降低變性劑的濃度，還要考慮每一階段的氧化還原狀態(tài)，以及溫度、添加劑等因素。在胰凝乳蛋白酶原的折疊復(fù)性中， M或高于3 M都會(huì)造成大量的沉淀， M濃度時(shí)有一半的蛋白質(zhì)沒有正確折疊，而在1 M時(shí)則完全折疊，說明折疊時(shí)的變性劑并不是越低越好，而是存在一個(gè)最佳濃度（13）。Tsumoto等通過分階段透析進(jìn)行了單鏈抗體Fv段包涵體的折疊復(fù)性，在1M鹽酸胍透析時(shí)加入氧化型谷胱甘肽和L精氨酸可以使正確折疊蛋白的得率達(dá)到95% 以上（40），進(jìn)一步研究表明在1M鹽酸胍條件下蛋白質(zhì)所具有的結(jié)構(gòu)使得自由巰基容易形成正確的二硫鍵，加入氧化型谷胱甘肽的作用是加速了蛋白質(zhì)的正確折疊、抑制蛋白質(zhì)的聚集，而L精氨酸起的作用是穩(wěn)定部分折疊的中間體使其不發(fā)生聚集，所以同時(shí)加入氧化型谷胱甘肽和L精氨酸可以將蛋白質(zhì)的聚集降到最低的程度（41）。這個(gè)研究小組用相同的方法進(jìn)行白介素12包涵體的折疊復(fù)性，僅加入氧化型谷胱甘肽而沒有還原型谷胱甘肽只有約57%的折疊效率，當(dāng)兩者同時(shí)加入后則可達(dá)到90%（42），這些結(jié)果表明前一種蛋白比較容易形成正確的二硫鍵，而白介素12折疊復(fù)性需要加入還原型的谷胱甘肽促進(jìn)二硫鍵重組，使蛋白質(zhì)最終選擇天然的二硫鍵，并促進(jìn)折疊。另一種策略是將變性蛋白分成幾份按一定的時(shí)間間隔逐步加入折疊緩沖液中，可以減少處理的體積、改善折疊的效率（35）。Arora等將這一方法用于人γ干擾素的復(fù)性，產(chǎn)品的得率和比活比文獻(xiàn)報(bào)道的都要高（72）。在 已經(jīng)發(fā)展的復(fù)性方法中，稀釋復(fù)性仍然是應(yīng)用最多的方法，但在放大時(shí)會(huì)因?yàn)樘幚眢w積太大造成成本太高。溶解復(fù)性獲得的蛋白質(zhì)，需要通過離心和過濾的方法去除 不溶性的物質(zhì)，再按可溶性蛋白質(zhì)的處理方法進(jìn)行下游的分離純化。擴(kuò)張床吸附技術(shù)可以處理大量的樣品，而且分離的效能不受聚集蛋白質(zhì)的影響，F(xiàn)erre等將蛋白質(zhì)的稀釋折疊和擴(kuò)張床吸附捕獲技術(shù)相偶聯(lián)，使用STREAMLINETM DEAE陰離子交換介質(zhì)，用于包涵體蛋白質(zhì)HAThβ2m的分離純化，可以得到48%回收率和94%純度的復(fù)性蛋白（23）。 色譜復(fù)性色 譜方法不僅在蛋白質(zhì)的純化中得到廣泛應(yīng)用，也成為包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性的主要手段之一。色譜復(fù)性的方法的優(yōu)點(diǎn)是可以顯著的減少處理的時(shí)間，減少變復(fù)性過程中分 子的聚集，使復(fù)性的同時(shí)也達(dá)到了純化的效果。第一類型的色譜復(fù)性就是凝膠過濾色譜復(fù)性，這一方法的原理在于通過分子篩效應(yīng)可將蛋白質(zhì)和小分子的變性劑分 離，實(shí)現(xiàn)溶液交換和蛋白質(zhì)的折疊。復(fù)性折疊中存在的一個(gè)問題就是蛋白質(zhì)的聚集，為了減少導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集的分子間相互作用，可將蛋白質(zhì)結(jié)合在分離介質(zhì)上，達(dá) 到溶液中變性劑濃度的稀釋和蛋白質(zhì)的折疊，這一類型的復(fù)性為吸附型色譜復(fù)性，包括親和色譜復(fù)性，疏水相互作用色譜復(fù)性，離子交換色譜復(fù)性。對(duì)于一些稀釋法 難于折疊的蛋白質(zhì)，這一方法具有更好的效果，如一些膜蛋白（24,50,71）。在折疊中，吸附的位點(diǎn)會(huì)影響到折疊，所以要優(yōu)化折疊的條件，才能得到好的折疊效果。另一種方法是在介質(zhì)上固定化伴侶分子或折疊酶，使層析柱成為一個(gè)折疊反應(yīng)器，固定化的優(yōu)點(diǎn)是能夠回收使用，不會(huì)引入新的雜蛋白。A. 凝膠過濾色譜復(fù)性凝膠過濾