【正文】 面的溫度及濕度應(yīng)穩(wěn)定，不可干燥。否則將影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。 (4)實(shí)驗(yàn)可注射給藥，但口服中藥消化道給藥，消化道灌胃給藥或十二指腸給藥，灌胃時(shí)，注意動(dòng)物提前 8— 12h禁食。 (5)在進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，排除干擾因素，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果。必要時(shí)同步測(cè)血氧、 pH等。 (二 )大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌梗死模型 I，原理 結(jié)扎大鼠的冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷其分布區(qū)域的心肌供血，心肌細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間缺血缺氧而造成不可逆損傷和壞死。 2．方法 取體重 200— 250g雄性大鼠，乙醚吸入或戊巴比妥鈉腹腔麻醉，仰臥固定，氣管插管，在胸骨側(cè)作 2cm的縱切口，近胸骨側(cè)剪斷第三第四肋軟骨，打開胸腔，聯(lián)接呼吸機(jī) (通氣量 2ml／ l00g， 50次／ min)。剪開心包膜，暴露心臟，冠狀動(dòng)脈左前降根部穿線以備結(jié)扎，記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖，穩(wěn)定 10min，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，關(guān)閉胸腔，用針筒或橡皮吸引吸出動(dòng)物喉部分泌物，使動(dòng)物恢復(fù)呼吸。 3 測(cè)定指標(biāo) (1)心電圖 ST段及 Q波標(biāo)測(cè)：記錄標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖及胸前導(dǎo)聯(lián)心電圖，測(cè) ∑— ST、病理性 Q波、嚴(yán)重心律失常等指標(biāo)。 (2)測(cè)定血漿生化指標(biāo)：如 IDH、 CPK、 ATP、 cAMP／ cGMP、 PGI2／TXA2等。 (3)梗死面積估算：處死動(dòng)物，取心臟橫切數(shù)片，測(cè)梗死面積，方法同前，但誤差較大。可用石蚶包坤組織塊切片，染色，顯微鏡下觀測(cè)，分級(jí)定度或用定量組織學(xué)方法直接算心肌梗死面積。 4．注意點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)方法在一般實(shí)驗(yàn)室條件均可進(jìn)行，方法簡(jiǎn)便，但動(dòng)物較小，操作不便，耐受缺氧時(shí)間不長(zhǎng)，心臟較小，實(shí)驗(yàn)誤差較大，可作為輔助試驗(yàn)。手術(shù)者必須熟悉冠狀動(dòng)脈的分布和解削位置，便于定位。操作者嚴(yán)格訓(xùn)練．操作熟練，手術(shù)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，部分結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后 ECG無(wú)改變者需剔除。 (三 )心肌缺血再灌注損傷模型 1．原理 心肌經(jīng)一定時(shí)間缺血 (缺氧 )后，突然恢復(fù)血 (氧 )供，形成更嚴(yán)重?fù)p傷，即“心肌缺血再灌注損傷”，其形成原因可能是心肌恢復(fù)血流時(shí)，加速細(xì)胞膜內(nèi)外的鈉鈣交換，大量鈣離子進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)，形成“鈣超載”：心肌細(xì)胞發(fā)生“拘縮”而喪失功能。心肌缺血再灌注損傷模型既可用于整體動(dòng)物，又能用于離體心臟和體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞。在藥效學(xué)研究可根據(jù)所試藥物的藥理作用及作用特點(diǎn)，選用不同的動(dòng)物和模型。 2 方法 (1)在體心臟心肌缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)可用多種動(dòng)物如，犬、小型豬、貓和大鼠等。一般采用阻斷局部冠狀動(dòng)脈血流一定時(shí)間，然后恢復(fù)冠脈血流，形成再灌注損傷。手術(shù)方法觀察指標(biāo)大致同前。 (2)離體心臟缺血再灌注損傷模型：實(shí)驗(yàn)一般用成年 Wistar種雄性大鼠，猛擊動(dòng)物頭部使昏迷，快速開胸，摘取心臟、立即放人 4℃ 改良 KrebsHensleit液中，主動(dòng)脈插管，裝于 Leaigendorff罐流裝置，以K— H液 (pH7． 4)恒溫 37℃ 進(jìn)行灌流。將兩電極分別于主動(dòng)脈及左心室壁，記錄心表面電圖。 實(shí)驗(yàn)程序：①預(yù)備灌流期，心臟正常灌流 (正常改良 K— H液 )，穩(wěn)定 l0min，給藥灌流 (含不同藥物的改良 KH液，實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行 )5min。②缺血期，以 00號(hào)線于左心耳部下力進(jìn)針，從肺動(dòng)脈圓錐旁穿出，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈 10min。③復(fù)灌期，剪斷結(jié)扎線，進(jìn)行再灌注 15min。 3 觀察指標(biāo) ①心表面電圖，記錄復(fù)灌后 5min出現(xiàn)的室性早搏 PVC個(gè)數(shù)對(duì)數(shù)值lgPVC及室速與室顫總時(shí)對(duì)數(shù)值。②心肌丙醛 (ADA)含量及越氧化物歧化酶 (s0D)活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剪下再灌區(qū)全層心肌約 0． 2g，制備勻漿進(jìn)行測(cè)定。③心肌離子含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以無(wú)鈣沖洗液 (三羥甲基氨基甲烷緩沖掖 )沖洗心肌，取再灌區(qū)層心肌約 o 2g，干燥至恒重，以硝酸消化溶解，無(wú)離子水稀釋至所需濃度，原子吸收分光光度汁或等離子休發(fā)射光譜儀測(cè)定鈉，鉀、鈣，鎂等離子含量。心肌梗死面積測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將心臟橫切染色，計(jì)算心肌梗死面積。 (四 )體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血樣損傷模型 1．原理 通常應(yīng)用 Wistar種大鼠乳鼠進(jìn)行原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)，用缺氧缺糖形成缺血樣損傷。心肌細(xì)胞缺氧缺糖后，功能從形態(tài)有明顯改變，如胞漿泡形成，胞漿顆粒增加出現(xiàn)異形心肌細(xì)胞等；經(jīng)活體染色證實(shí)細(xì)胞死亡數(shù)增加；搏動(dòng)頻率下降，動(dòng)作電位改變；胞漿的乳酸脫氫酶，羥酸脫氫酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用這些指標(biāo)評(píng)定藥物對(duì)心肌細(xì)胞缺血樣損傷的保護(hù)作用。 2．方法 取出生 2— 3曰乳鼠，開胸、取心室，放人盛有 Eagle培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗3次，三角燒瓶中用眼科剪將心室組織剪成碎塊，加入 0． 06％胰蛋白酶溶液。在攪拌器上 37℃ 水浴消化 10min．自然沉淀后，丟上消液，沉淀的組織塊再加入胰蛋白酶，消化 l0min，然后吹打 1min，自然沉淀，上清移人離心骨中。加入等量冷培養(yǎng)基以終止消化，離 10min(2022r／ min)，棄上清，再加入適量培養(yǎng)基于離心管內(nèi)的細(xì)胞沉淀中，混勻，離心，棄上清以洗殘存的胰蛋白酶，加入 15％ Eagle培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液。將自然沉淀的組織塊反復(fù)消化數(shù)次，直至完全分散為止。將各次消化制的細(xì)胞懸液集中，制成心肌細(xì)胞懸液，接種至玻璃培養(yǎng)瓶，塞緊， 37c下靜置單層培養(yǎng)或在二氧化碳培養(yǎng)鞘開放培養(yǎng)。 體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧缺糖性損傷模型的建立方法：取培養(yǎng) 3日的心肌細(xì)胞，按下法進(jìn)行缺氧缺糖實(shí)驗(yàn)．①缺糖：實(shí)驗(yàn)時(shí)采用無(wú)糖液或不含糖的 Eagle培養(yǎng)基代替正常培養(yǎng)。②缺氧：將無(wú)糖 Hanks液或無(wú)糖培養(yǎng)基預(yù)先用純氮?dú)?(％ )飽和15min；實(shí)驗(yàn)時(shí)換人這種缺氧缺糖液或培養(yǎng)基，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)再充人氮?dú)?1l/min)30s．以置換瓶?jī)?nèi)空氣，然后塞緊瓶塞。正常對(duì)照組用正常 Hanks液或培養(yǎng)基，不充氮?dú)?，如用二氧化碳培養(yǎng)箱加以培養(yǎng)，則通人 95％ N2+5％ C02氣體形成缺氧。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧損傷，開觀察藥物對(duì)供氧損傷的影響。 3．測(cè)定指標(biāo) (1)形態(tài)學(xué)觀察：用臺(tái)盼蘭染色進(jìn)行死活細(xì)胞鑒定，觀察細(xì)胞活力的改變及死亡比例，光學(xué)顯微鏡下可觀測(cè)心肌細(xì)胞形態(tài)變化，如偽足變化、胞泡形成、胞漿顆粒增加、異形 (長(zhǎng)形、紡錘形 )心肌細(xì)胞的出現(xiàn)。在掃描或透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。 (2)心肌細(xì)胞搏動(dòng)的變化：包括搏動(dòng)的頻率、節(jié)律及強(qiáng)度等。 (3)胞漿酶的釋放：可用生化或細(xì)胞化學(xué)方法測(cè)定缺氧缺糖后心肌細(xì)胞內(nèi)從培養(yǎng)基中酶的變化，如 IDH、 CPK、羥酸脫敏酶、轉(zhuǎn)氨酶等的變化。 (4)其他：測(cè)定細(xì)胞內(nèi)氧化物歧化酶的變化從鈣離子運(yùn)轉(zhuǎn)等。 上述觀測(cè)指標(biāo)綜合選用，以判斷心肌細(xì)胞損傷程度及藥物保護(hù)作用。 4．方法學(xué)評(píng)價(jià) 優(yōu)點(diǎn)：①觀察藥物對(duì)心肌細(xì)胞的直接作用，可排除藥物通過(guò)其他間接影響心肌缺血氧的作用。②節(jié)約藥物，適用于分離或合成得到的極少藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。③適用于從細(xì)胞或分子水平進(jìn)行機(jī)制研究。 局限性：①技術(shù)設(shè)備要求高。②不適于觀察不溶于水或含雜質(zhì)的粗制藥物，或非直接作用心肌細(xì)胞的藥物的作用。因此，本法應(yīng)與整體或器官水平的實(shí)驗(yàn)配合進(jìn)行，以便更全面的判斷藥效。 (五 )藥物誘發(fā)心肌缺血模型 近年研究認(rèn)為冠狀動(dòng)脈痙攣是導(dǎo)致心肌急性缺血的主要原因之 — ．致心絞痛、心肌梗死和猝死。目前常用垂體后葉素在整體動(dòng)物 (犬、小型豬、兔、豚鼠，大鼠 )或離體心臟上造成冠脈痙攣心肌缺血模型，或用兒茶酚胺類藥物引起心肌缺血的方法，以評(píng)價(jià)抗心肌缺血藥物的療效。 l、垂體后葉素誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：垂體后葉素能使冠狀動(dòng)脈痙攣，造成急性心肌供血不足，從外周阻力增加．導(dǎo)致心臟負(fù)荷加重，心電圖可見(jiàn)心肌缺血的典型變化，適用于緩解冠狀動(dòng)脈痙攣以防治心肌缺血藥物的初篩方法；垂體后葉素能收縮全身 (特別是內(nèi)臟 )小血管，作用是非特異的。 (2)方法： 大鼠缺血模型：取體重 200g健康大鼠，腹腔注射烏拉坦麻醉，仰臥固定，將電極插入四肢及胸前心尖搏動(dòng)處皮下，調(diào)節(jié)心電圖靈敏度 1mV=15mm，紙速為50mm/s，可璉接心電示波器連續(xù)觀察心電變化，記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或?qū)?lián)心電圖。實(shí)驗(yàn)前有心電圖或心律失常異常變化，則棄去不用，根據(jù)所試藥物特點(diǎn)選擇適當(dāng)給藥途徑和間隔，靜脈給后 1— 5min腹腔注射后 15— 30min，灌胃后 12h，經(jīng)下靜脈或尾靜脈注射垂體后葉素 0． 5或 0． 7u／ kg，注射速度 5s或 l0s。注射后即刻、 5s、 10s、 15s及 30s、 lmin、 2min及 5min，重復(fù)記錄心電圖 (記錄時(shí)間可據(jù)示波器所示異常情況決定 )。 正常大鼠注射腦垂體后葉素后心電圖變化分兩期： 第一期，注射即刻至 30s， T波升高， ST段抬高 (超過(guò) o． 1mV)，尤以 l0s變化最明顯。 第二期，注射后 30s至數(shù)分鐘， T波低．雙相、倒置，心率變慢， P— R及 Q— T間期延長(zhǎng)。 判定標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)第一期或第二期缺血變化為陽(yáng)性，否則為陰性，比較各組的差異，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 家兔缺血模型：健康家兔，體重 2— 3kg，在清醒或麻醉狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄胸前導(dǎo)聯(lián)或 D導(dǎo)聯(lián)心電圖，耳靜脈 30s注入垂休后葉素 2． 5u／ kg，心肌缺血的心電變化急劇，不便判斷藥效，亦可改用靜脈滴注法，即在 l0min內(nèi)恒速滴人上述劑量的垂體后葉素，心電圖變化可持續(xù)到 15— 30min，除上述缺血性心電圖變化外，偶有竇性心律失常、室性早搏、室性心動(dòng)過(guò)速等心律失常發(fā)生。 判定指標(biāo)同大鼠。 2，異丙腎上腺素誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：異丙腎上腺素為受體興奮劑．通過(guò)加快心率增加心肌收縮力等環(huán)節(jié)，增加心肌耗氧量，造成心臟負(fù)荷過(guò)重，心肌微循環(huán)障礙，連續(xù)應(yīng)用可形成心肌損傷，可用心電圖和病理方法觀測(cè)病變程度。適用調(diào)節(jié)心肌代謝、氧供需平衡及作用于受體藥物的研究； (2)方法：健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓或犬均可。經(jīng)心電圖檢查，棄去心電圖有異常改變或心律失常。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射異丙腎上腺素 2— 8mg／ kg，家兔 10— 16mg/kg連續(xù)兩日，第一次和第二次紿異丙腎上腺素后 30min內(nèi)，每隔 5min記錄心電圖一次，第二次給藥后 24h記錄心電圖后殺死動(dòng)物，取心臟做病理切片檢查。 異丙腎上腺素可引起 T波倒置或雙相，有 ST段抬高，竇性心動(dòng)過(guò)速 (心率明顯加快 )，早搏或伴有其他心律失常。心肌病理觀察可見(jiàn)：白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維腫脹、斷裂、橫 紋消失、甚至溶解，發(fā)生玻璃樣變和脂肪變性等。比較各心電圖和病理變化，以判斷藥效。 (3)注意點(diǎn)：適用于研究影響心肌氧代謝平衡或作用受體而防治心肌缺 血的藥物，用心電圖難于定量觀測(cè)藥物的作用，須用病理觀測(cè)，但制備病理標(biāo)本及觀察 量較大，難準(zhǔn)確定量，是其缺點(diǎn)，可用分級(jí)定度或半定量法觀測(cè)。 3．麥角新堿誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：動(dòng)物左冠狀動(dòng)脈干注入麥角新堿，可誘發(fā)明顯的冠狀動(dòng)脈痙攣 和血流動(dòng)力學(xué)改變：平均動(dòng)脈壓、冠脈壓和肺動(dòng)脈壓及外周阻力增加，心排出量下降，乙電圖 STT抬高， 60％發(fā)生室性心律失常，左冠狀動(dòng)脈造影顯示狹窄率達(dá) 50％ — 75％，動(dòng)脈血氧下 降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺環(huán)素下降，顯示急性心肌缺血缺氧全身高凝狀態(tài) 的病理生理改變：、病理學(xué)證實(shí)，心肌有缺血壞死性改變及冠脈血栓形成。這種動(dòng)物模型 可用以評(píng)價(jià)通過(guò)緩解冠狀動(dòng)脈痙攣、攻善血液流變性等多種途徑．防治心肌缺血的藥物。 (2)方法：健康犬，體重 lo— 20kg，戊巴比妥鈉 30mg／ kg注射麻酢，自右側(cè)股動(dòng)脈插入導(dǎo) 管至左冠脈主干，以麥角新堿 ／ kg于生理鹽水， lmin內(nèi)拄入，可形 成冠脈痙攣及心肌缺血。 (3)觀測(cè)指標(biāo)：心電圖或體表標(biāo)測(cè)心電圖 ∑— ST及 N— ST改變。血流動(dòng)力學(xué) 改變。生化指標(biāo)： CPK、血小板聚集、 TXB kelo— PGF等變化。心臟病理學(xué) 改變。 (4)注意事項(xiàng)：本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)是不開胸，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，通過(guò)心電圖、血流動(dòng)力學(xué)、生化 和病理研究以評(píng)價(jià)抗心肌缺血藥的治療作用。但設(shè)備及技術(shù)要求較高，如血流動(dòng)力學(xué)的測(cè) 定需要帶熱敏電阻的 SwanGmlg四腔導(dǎo)管等。為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)方法，可試用貓、兔、大鼠或豚鼠 按照垂體后葉素實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。 (六 )心臟血流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 1．原理 心肌缺血往往伴隨心臟血流動(dòng)力學(xué)改變，人部分治療缺血性心臟病的有效藥 物均可改善血流動(dòng)力學(xué)而發(fā)揮作用。因此，心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)應(yīng)作為主要藥效學(xué)研 究?jī)?nèi)容。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可用犬、小型楮、貓或大鼠，但后兩種動(dòng)物心臟較小，某些指標(biāo)不宜直接觀 測(cè)，犬和小型豬應(yīng)作為首選動(dòng)物。 2．方法 健康犬或小型堵，雌雄兼用，體重 1215kg實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用戊巴比妥鈉 (30mg／ kg) 靜脈麻酐，手術(shù)臺(tái)固定，分離氣管并插管，連接電動(dòng)呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)潮氣量300— 600ml，動(dòng)脈氧 分壓維持在如 —