【正文】 型 1．原理 心肌經(jīng)一定時間缺血 (缺氧 )后，突然恢復血 (氧 )供，形成更嚴重損傷，即“心肌缺血再灌注損傷”，其形成原因可能是心肌恢復血流時，加速細胞膜內(nèi)外的鈉鈣交換，大量鈣離子進人細胞內(nèi)，形成“鈣超載”：心肌細胞發(fā)生“拘縮”而喪失功能?？捎檬腊そM織塊切片，染色，顯微鏡下觀測，分級定度或用定量組織學方法直接算心肌梗死面積。剪開心包膜，暴露心臟，冠狀動脈左前降根部穿線以備結扎，記錄標準導聯(lián)心電圖，穩(wěn)定 10min，結扎冠狀動脈左前降支，關閉胸腔，用針筒或橡皮吸引吸出動物喉部分泌物，使動物恢復呼吸。 (5)在進行本項實驗時一定要嚴格控制實驗條件，排除干擾因素，確保實驗結果。心外膜電極放置的位置，或反復測定的位置應準確固定，不應移位。 (4)血液流變性指標測定：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測定全血黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細胞比容、紅細胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流變學指標。 (3)生化指標：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測量血中乳酸脫氫酶的變化，分析心肌損傷情況。確定心肌缺血以 ST段抬高作為指標，以 ST段抬高 ≥2mv的點數(shù)(N— ST)代表心肌缺血的范圍，以各點段抬高的毫伏數(shù)之和 (∑— ST)代表心肌缺血的程度。 3．藥物療效判斷 (1)心外膜電圖標測：心外膜標測點的定位應包括缺血中心區(qū)、邊緣區(qū)和非缺血區(qū)，標測方法：將心電極固定于具有一定彈性的無刺激性材料作成的片子上，該片四角縫于心外膜，如多點固定式心外膜電極。環(huán)植人 4— 6星期，血骨內(nèi)徑縮小 80％ 90％。 (2)冠狀動脈血栓形成法：將弧型針狀電極 (刺激電極 )置于分離的冠狀動脈下，另一電極 (參考電極 )距刺激電極 o． 6mm處置于心外膜下，兩電極分別連接電刺激儀的隔離器正負極，以 2． lmA直流電刺激冠狀動脈30min左右，冠狀動脈內(nèi)血栓形成，阻斷冠狀動脈血流，誘發(fā)心肌缺血。西藥劑量與中藥量相差較大，作用特點亦不大相同，不做藥效強度比較。 4．氧代謝試驗 增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代謝是藥物治療缺血心臟病的重要作用。常用免或大鼠以 Chmldlcr血栓形成法，測定心栓的重量及長度；應用大鼠以動 — 靜脈旁路法測定血栓濕重；電刺激人鼠頸總動脈形成動脈血栓，用以觀察藥物對體內(nèi)血栓形成時間的影響 。實驗動物用兔或大鼠。 (3)無創(chuàng)性心功能檢查：如超聲心動圖、阻抗圖、 Y— 照相等。應作為新藥主要藥效學的首選試驗。⑥心肌區(qū)域血流量的測定。②核示蹤法，利用放射核鉈依靠鈉泵進行轉運而不能進入缺血或壞死細胞的特點，通過閃爍照相來觀察心肌缺血部位及范圍。 (2)間接測定心肌梗死范圍：①心外膜電圖標測法，阻斷或縮窄冠狀動脈形成心肌缺血及心肌梗死，以多點心外膜電圖標測心肌缺血的程度和范圍的變化。染色或 TIC染色或雙重染色 )觀察心肌梗死面積的改變。 (5)心肌缺血冉灌注損傷模型：整體動物心臟缺血再灌注損傷．離體心臟和心肌細胞缺氧缺糖再灌注損傷等模型。 (一 )對心肌缺血心肌梗死的防治作用試驗 1．常用動物模型 (1)冠狀動脈阻斷或縮窄形成心肌缺血和心肌梗死模型：通過阻斷或縮窄冠狀動脈方法，如結扎、電刺激、氣囊法，血管內(nèi)異物法及注入凝血酶或ADP法等。 改善心臟血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代謝，緩解心絞痛，減小心肌梗死面積是藥物治療的主要目的。本虛以臟氣虧虛為主．可兼陰虛；標實以血瘀痰阻多見，可兼氣滯、寒凝。缺血性心臟病 (心絞痛、心肌梗死 )藥 一、實驗設計的醫(yī)學基礎 根據(jù)缺血性心臟病 (心絞痛、急性心肌梗死 )的主要癥狀發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范疇?；局畏樾酝?，活血化瘀，芳香溫通及扶正固本。 二、藥效學研究的實驗設計 缺血性心臟病需要進行的藥效學實驗較多， — 般應以整體動物實驗為基礎，根據(jù)藥物特點及實驗要求適當選用器官、組織、細胞及分子水平的實驗，多層次實驗相結合，有利于重復驗證和說明作用原理。 (2)藥物誘發(fā)心肌缺血模型：通過藥物誘發(fā)冠脈痙攣法，如垂體后葉素、麥角新堿，以及通過增加心肌耗氧法，如異丙腎亡腺素等。 以上心肌缺血模型第一項可用于急性和慢性心肌缺血實驗，可觀察藥物的藥理作用、起效及作用時間等。②病理切片顯微鏡檢查，鏡下觀測心肌病變程度和范圍。②酶學指標觀測，測定血中磷酸肌酸激酶 (CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)等與心肌損傷相關的酶類變化，動態(tài)觀察心肌損傷情況，定量分析心肌損傷程度。③放射自顯影法觀察缺血區(qū)。 (4)其他可供分析的指標：心肌代謝指標，如心肌氧代謝，其他物質(zhì)及能量代謝，如 FFA、 ATP、 PGI TXA cAMP/cGMP， SOD、MDA、乳酸、鉀、鈣、鎂離子、血凝狀態(tài)及血液流變性等。 (二 )對心臟血流動力學及心肌耗氧量影響試驗 1．實驗動物與觀測指標 (1)犬心功能及血流動力學實驗：觀察指標應包括心電圖、心率。 2．方法學評價 心臟血流動力學、心肌耗氧量等應作為評階藥物作用及作用機制的重要指標，對于了解藥物對心肌功能、血管順應性、心肌供血及心肌氧代謝的影響，結合對心肌缺血、心肌梗死等指標的影響，作綜合性評價有重要意義。以三磷酸腺稈、花生四烯酸 (AA)、膠原、凝血酶等作為繡導劑，應用比濁法或其他方法測定。電刺激犬或豬的冠狀動脈形成冠狀動脈血栓，以心肌缺血程度范圍、心肌梗死、心肌酶及冠脈血栓占管腔的百分比等多項指標綜合觀察藥物對心肌缺血的防治作用和溶栓作用。方法除前面介紹的心肌耗氧量測定外，可同時選用小鼠常壓、低壓耐缺氧等實驗和指標。采用中藥陽性藥時，一股應選療效肯定的功能主治相似的中成藥對照，對照藥應是藥典記載或經(jīng)衛(wèi)生部批準生產(chǎn)的；對照藥劑應與受試藥等效或相當，以便進行比較，同一受試藥的不同藥效學實驗選用不同的陽性對照藥。 (3)冠狀動脈氣囊壓迫法：壓迫環(huán)由有機玻璃外套和可膨脹的乳膠小囊構成，外套長 5mm側面 lmm的縫隙，血管由此進入肺內(nèi)，小囊長 3— 4mm，一端密閉，一端與塑料管相連，充滿蒸餾水或生理鹽水，經(jīng)塑料管注水 30— 40ul使小囊膨脹以壓迫套內(nèi)的血管，當壓力去除時，小囊恢復原狀，冠狀動脈重新通暢，適用于急性和慢性心肌缺血或再灌實驗。 (5)清醒動物心肌缺血實驗：將氣囊壓迫環(huán)固定在冠狀動脈適當部位，縫合心包，放置心包膜電極，氣囊的導管電極的導線分別穿過胸壁引出皮外，逐層縫閉胸。或直接將每個電極固定于心外膜表面，或用一個燈芯電極按順序點測標測點。記錄阻斷冠脈血流前后的變化及藥物的影響。為避免具他肌肉組織釋放的酶干擾，測同工酶。 4 注意點 犬和小型豬是建立心肌缺血模型最常用的動物，其體積大小適中，性情溫順、易訓練、心臟解剖及生理特點與人相似，其影響因素有： (1)動物冠狀動脈分支及側支循環(huán)有個體差異，對分支及側支變異大的，不合標準的應剔除不用，各組動物模型心肌缺血程度和范圍接近。電極不可對心臟壓力過大，心臟表面的溫度及濕度應穩(wěn)定，不可干燥。必要時同步測血氧、 pH等。 3 測定指標 (1)心電圖 ST段及 Q波標測：記錄標準導聯(lián)心電圖及胸前導聯(lián)心電圖，測 ∑— ST、病理性 Q波、嚴重心律失常等指標。 4．注意點 本實驗方法在一般實驗室條件均可進行，方法簡便，但動物較小，操作不便，耐受缺氧時間不長，心臟較小，實驗誤差較大，可作為輔助試驗。心肌缺血再灌注損傷模型既可用于整體動物，又能用于離體心臟和體外培養(yǎng)心肌細胞。手術方法觀察指標大致同前。②缺血期，以 00號線于左心耳部下力進針，從肺動脈圓錐旁穿出，結扎冠狀動脈 10min。③心肌離子含量測定，實驗結束后，以無鈣沖洗液 (三羥甲基氨基甲烷緩沖掖 )沖洗心肌，取再灌區(qū)層心肌約 o 2g，干燥至恒重，以硝酸消化溶解，無離子水稀釋至所需濃度，原子吸收分光光度汁或等離子休發(fā)射光譜儀測定鈉，鉀、鈣，鎂等離子含量。 2．方法 取出生 2— 3曰乳鼠，開胸、取心室，放人盛有 Eagle培養(yǎng)皿中，反復沖洗3次，三角燒瓶中用眼科剪將心室組織剪成碎塊，加入 0． 06％胰蛋白酶溶液。將各次消化制的細胞懸液集中，制成心肌細胞懸液，接種至玻璃培養(yǎng)瓶，塞緊， 37c下靜置單層培養(yǎng)或在二氧化碳培養(yǎng)鞘開放培養(yǎng)。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧損傷，開觀察藥物對供氧損傷的影響。 (3)胞漿酶的釋放：可用生化或細胞化學方法測定缺氧缺糖后心肌細胞內(nèi)從培養(yǎng)基中酶的變化，如 IDH、 CPK、羥酸脫敏酶、轉氨酶等的變化。②節(jié)約藥物，適用于分離或合成得到的極少藥物進行實驗。因此，本法應與整體或器官水平的實驗配合進行，以便更全面的判斷藥效。 (2)方法： 大鼠缺血模型：取體重 200g健康大鼠，腹腔注射烏拉坦麻醉，仰臥固定，將電極插入四肢及胸前心尖搏動處皮下，調(diào)節(jié)心電圖靈敏度 1mV=15mm，紙速為50mm/s，可璉接心電示波器連續(xù)觀察心電變化，記錄胸前導聯(lián)或?qū)?lián)心電圖。 第二期，注射后 30s至數(shù)分鐘， T波低．雙相、倒置，心率變慢， P— R及 Q— T間期延長。 2，異丙腎上腺素誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：異丙腎上腺素為受體興奮劑．通過加快心率增加心肌收縮力等環(huán)節(jié)，增加心肌耗氧量，造成心臟負荷過重，心肌微循環(huán)障礙，連續(xù)應用可形成心肌損傷，可用心電圖和病理方法觀測病變程度。 異丙腎上腺素可引起 T波倒置或雙相，有 ST段抬高，竇性心動過速 (心率明顯加快 )，早搏或伴有其他心律失常。 3．麥角新堿誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：動物左冠狀動脈干注入麥角新堿，可誘發(fā)明顯的冠狀動脈痙攣 和血流動力學改變：平均動脈壓、冠脈壓和肺動脈壓及外周阻力增加，心排出量下降，乙電圖 STT抬高， 60％發(fā)生室性心律失常，左冠狀動脈造影顯示狹窄率達 50％ — 75％，動脈血氧下 降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺環(huán)素下降，顯示急性心肌缺血缺氧全身高凝狀態(tài) 的病理生理改變：、病理學證實，心肌有缺血壞死性改變及冠脈血栓形成。血流動力學 改變。但設備及技術要求較高，如血流動力學的測 定需要帶熱敏電阻的 SwanGmlg四腔導管等。實驗動物可用犬、小型楮、貓或大鼠，但后兩種動物心臟較小，某些指標不宜直接觀 測，犬和小型豬應作為首選動物。頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇，動脈插管，以血氧測定儀或血氣分析儀分別測定冠狀靜脈血氧含量及動脈血氧含量，計算心肌耗氧量。 3. 注意點 本實驗難度較大，耍具備成套精密儀器。多年來，國內(nèi)外對擴張冠狀動脈的藥物進行廣泛、系統(tǒng)、深入的研究：，雖然能增加冠脈血流量的藥物很多，但不一定都有防治心肌缺血的作用。 2．方法 (1)犬冠脈循環(huán)實驗法：冠脈血流量測定，手術方法與步驟同心臟血流動力學試驗。放相應直徑電磁流量計探頭．測量心輸出量。插前，靜脈注入肝素 750u／ kg。給藥后不同時間，分別紀錄各值，反流量推算單位壓力差下冠脈惻支血管流量 (CVC)=反流量／動脈舒張壓，以此反映側支血流阻力變化。 (3)Rb測定心肌營養(yǎng)血流量：冠脈血流除了通過毛細血管為心肌提供營養(yǎng)性血流外，一部分血流經(jīng)動 — 靜脈吻合支分流人靜脈，兩者構成冠脈總血流量。 方法：取體重 24g的健康小鼠分組，給藥或?qū)φ账幒蟾粢欢〞r間，根據(jù)待試藥物的藥代動力學過程確定，從尾靜脈注射 RbCl生理鹽水溶液o． 1ml(4000— 10000脈沖／ min)， 5s注入，注射后 30s，立即處死動物，取心臟，用生理鹽水沖洗 4次，每次 l0ml。② Rb量及動物處死時間要準確，井將心臟的動靜脈全部剪掉。實驗結束時取出心，剔除表面的脂肪、血管與心瓣膜，將左窒壁切割成每份重 1～ 2g的組織塊，每塊分成內(nèi)膜下、中間與外膜下心肌層。用以研究藥物對心肌缺血時不同部位，不問層次的心肌血流量的影響。心臟表面放置鉑電極，連接電刺激，用于心臟起搏。 實驗中供氧，溫度、灌流壓力及灌液 PH要固定不變。為排除這種影響，可先心臟纖顫，然后觀察約物對冠脈流量的影響。停心肌供氧，經(jīng) 3次收縮即出現(xiàn)缺氧，因此，心肌耗氧測定是研究防治冠心病藥物的重要指標。②心肌氧張力測定，極譜儀的鉑電極插入丌胸犬的心肌，連續(xù)紀錄心肌氧張力的變化?；蛴猛呤虾粑鳒y定心肌的耗氧量。 ②心肌耗氧指數(shù)，根據(jù)左心室需氧量決定于心率及收縮壓的原理，間接推算心肌耗氧量的變化。②大鼠心肺灌流耐缺氧實驗，此法除可反映離體心臟的耐缺氧能力和藥物作用外，可同時測定血壓、心輸出、心房壓及靜脈壓等各項指標，說明這些因素與心肌耐缺氧之間的關系以及藥物的作用。④其他，小鼠常壓或減壓缺氧實驗，方法簡單，應用廣，反映整體 (特別是腦組織 )的耐缺氧能力，但特異性差，不能反映心肌的耐缺氧力，易受鎮(zhèn)靜、催眠或刺激性藥物的影響，出現(xiàn)假陽性。酶學研究．如磷酸肌酸酶 (CPK)可以定量地反映心肌損傷的程度，乳酸脫氧酶及天冬氨酸轉氨酶 (AST)等，也常用以反映心肌損傷度。 (1)心肌耗氧量直接測定法：經(jīng)冠狀靜脈竇和頸總動脈插管，抽取冠狀靜脈和頸總動脈血，以血氧測定儀或血氣分析儀直接測定血氧含量算心肌