【正文】 缺血性心臟病 (心絞痛、心肌梗死 )藥 一、實驗設(shè)計的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ) 根據(jù)缺血性心臟病 (心絞痛、急性心肌梗死 )的主要癥狀發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)將其歸屬于“厥心痛”、“真心痛”、“胸痹”范疇。病位以心腎為主?；静C為本虛標(biāo)實。本虛以臟氣虧虛為主．可兼陰虛；標(biāo)實以血瘀痰阻多見，可兼氣滯、寒凝?；局畏樾酝?，活血化瘀，芳香溫通及扶正固本。 缺血性心臟病可由不同病因引起，最常見的原因是冠狀動脈粥樣硬化、冠狀動脈血栓及冠狀動脈痙攣。其共同特點是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而發(fā)生的一系列病理生理改變及證候。 改善心臟血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代謝，緩解心絞痛，減小心肌梗死面積是藥物治療的主要目的。 二、藥效學(xué)研究的實驗設(shè)計 缺血性心臟病需要進行的藥效學(xué)實驗較多， — 般應(yīng)以整體動物實驗為基礎(chǔ)，根據(jù)藥物特點及實驗要求適當(dāng)選用器官、組織、細胞及分子水平的實驗，多層次實驗相結(jié)合，有利于重復(fù)驗證和說明作用原理。但由于缺血性心肌發(fā)病機制復(fù)雜，防治的途徑，方法及藥物類型亦較復(fù)雜。應(yīng)明確研究的思路，作用的途徑，選擇適宜的主要藥效學(xué)實驗方法及必要的觀測指標(biāo)，進行止確的分析判斷，以求得科學(xué)的結(jié)論。 (一 )對心肌缺血心肌梗死的防治作用試驗 1．常用動物模型 (1)冠狀動脈阻斷或縮窄形成心肌缺血和心肌梗死模型：通過阻斷或縮窄冠狀動脈方法，如結(jié)扎、電刺激、氣囊法，血管內(nèi)異物法及注入凝血酶或ADP法等。 (2)藥物誘發(fā)心肌缺血模型：通過藥物誘發(fā)冠脈痙攣法，如垂體后葉素、麥角新堿，以及通過增加心肌耗氧法，如異丙腎亡腺素等。 (3)離體實驗心肌缺血模型：結(jié)扎離體心臟冠狀動脈法、離體心臟低氧或無氧灌流法。 (4)體外培養(yǎng)心肌細胞缺血樣損傷模型：控制心肌細胞的供氧和培養(yǎng)基中的含糖量，形成“缺血樣損傷”模型。 (5)心肌缺血冉灌注損傷模型：整體動物心臟缺血再灌注損傷．離體心臟和心肌細胞缺氧缺糖再灌注損傷等模型。 以上心肌缺血模型第一項可用于急性和慢性心肌缺血實驗，可觀察藥物的藥理作用、起效及作用時間等。其余均為急性心肌缺血模型，可作藥物作用機制分析研究。 2．觀察指標(biāo) (1)直接測定心肌梗死范圍：①大體標(biāo)本活體染色法，以定量組織學(xué) (N—BI39。染色或 TIC染色或雙重染色 )觀察心肌梗死面積的改變。②病理切片顯微鏡檢查，鏡下觀測心肌病變程度和范圍。③病理切片熒光照相法，利用四環(huán)素能與心肌壞死細胞中的鈣整合的特性，在切片上進行熒光照相，以測定梗死面積。④電子顯微鏡觀察細胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核及染色質(zhì)等心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 (2)間接測定心肌梗死范圍：①心外膜電圖標(biāo)測法，阻斷或縮窄冠狀動脈形成心肌缺血及心肌梗死，以多點心外膜電圖標(biāo)測心肌缺血的程度和范圍的變化。②酶學(xué)指標(biāo)觀測，測定血中磷酸肌酸激酶 (CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)等與心肌損傷相關(guān)的酶類變化，動態(tài)觀察心肌損傷情況，定量分析心肌損傷程度。③核示蹤法，將肘心肌壞死有親和力的物質(zhì)進行核索標(biāo)記來觀察梗死情況，常用的有锝 — 四環(huán)素和锝 — 焦磷酸亞錫。 (3)缺血區(qū)測定指標(biāo)：①染料及熒光素法，通過從冠脈注入染料或熒光素，然后進行肌切片觀察心臟血流灌注情況，從而計算無染料(或熒光 )的面積 (即缺血面積 )，如合并應(yīng)用 N— BT做活體雙重染色法可計算梗死面積與缺血面積的比值。②核示蹤法，利用放射核鉈依靠鈉泵進行轉(zhuǎn)運而不能進入缺血或壞死細胞的特點，通過閃爍照相來觀察心肌缺血部位及范圍。③放射自顯影法觀察缺血區(qū)。④心表面熒光法，用表面熒光照相來分析缺血 K情況。⑤冠脈血流量、冠脈返流量及返流壓的測定。⑥心肌區(qū)域血流量的測定。 (4)其他可供分析的指標(biāo)：心肌代謝指標(biāo)，如心肌氧代謝，其他物質(zhì)及能量代謝，如 FFA、 ATP、 PGI TXA cAMP/cGMP， SOD、MDA、乳酸、鉀、鈣、鎂離子、血凝狀態(tài)及血液流變性等。 3．方法學(xué)評價 以上各項試驗方法中，以阻斷動物的冠狀動脈所致之局限性心肌缺血是目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的方法，通過狹窄或完全閉塞冠狀動脈，使其供應(yīng)區(qū)的血流減少或缺無，造成心肌缺血，心肌因缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂，以致發(fā)生凝固性壞死，其發(fā)病過程和機制與臨床相似，與中醫(yī)理論“瘀血證”有一定聯(lián)系，較為合理、實用?？筛鶕?jù)所試藥物功能、主治和作用特點選用上述形態(tài)、電生理、生化、放免、核示蹤、熒光等觀測指標(biāo)與方法，可以定位、定性、定量的觀測缺血心肌的動態(tài)變化及藥物影響，較為準(zhǔn)確的評價藥效。應(yīng)作為新藥主要藥效學(xué)的首選試驗。 (二 )對心臟血流動力學(xué)及心肌耗氧量影響試驗 1．實驗動物與觀測指標(biāo) (1)犬心功能及血流動力學(xué)實驗：觀察指標(biāo)應(yīng)包括心電圖、心率。動脈血壓、冠脈流量，冠脈阻力、心輸出量、心肌收縮力、左室做功、左室內(nèi)壓、左室內(nèi)壓最大上升速率、心搏出量、心臟指數(shù)、心搏指數(shù)、總外周阻力等，并可同時測定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指數(shù)等。 (2)貓、鼠等其他動物心功能及血流動力學(xué)試驗：觀察指標(biāo)應(yīng)包括心電圖、心率，動脈血壓、心輸出量、左室內(nèi)壓、左室內(nèi)壓最大上升速率、中心靜脈壓、左室別血的張力指數(shù)、左室作功指數(shù)、心臟指數(shù)、左室舒張未期壓等。 (3)無創(chuàng)性心功能檢查：如超聲心動圖、阻抗圖、 Y— 照相等。 2．方法學(xué)評價 心臟血流動力學(xué)、心肌耗氧量等應(yīng)作為評階藥物作用及作用機制的重要指標(biāo)，對于了解藥物對心肌功能、血管順應(yīng)性、心肌供血及心肌氧代謝的影響，結(jié)合對心肌缺血、心肌梗死等指標(biāo)的影響，作綜合性評價有重要意義。 (三 )其他試驗 1．血小板聚集性試驗 血小板聚集性增強是造成血液循環(huán)障礙導(dǎo)致心肌缺血發(fā)生的重要原因之一。藥物對動物血小板聚集性的影響可作為藥效學(xué)研究的輔助指標(biāo)。實驗動物用兔或大鼠。以三磷酸腺稈、花生四烯酸 (AA)、膠原、凝血酶等作為繡導(dǎo)劑，應(yīng)用比濁法或其他方法測定。 2．血栓形成及溶栓試驗 冠狀動脈血栓形成是直接導(dǎo)致心肌缺血因素之一。對血栓形成的影響和溶栓作用應(yīng)為評價治療心肌缺血藥物藥效的輔助指標(biāo)。常用免或大鼠以 Chmldlcr血栓形成法，測定心栓的重量及長度；應(yīng)用大鼠以動 — 靜脈旁路法測定血栓濕重；電刺激人鼠頸總動脈形成動脈血栓，用以觀察藥物對體內(nèi)血栓形成時間的影響 。電刺激犬或豬的冠狀動脈形成冠狀動脈血栓，以心肌缺血程度范圍、心肌梗死、心肌酶及冠脈血栓占管腔的百分比等多項指標(biāo)綜合觀察藥物對心肌缺血的防治作用和溶栓作用。 3．血液流變學(xué)試驗 心肌缺血發(fā)生前后，常伴有血液流變學(xué)改變。因此，測定血液黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細胞比容、紅細胞沉降、血小板黏附和聚集等血液流變學(xué)指標(biāo)，對評價藥物的作用有重要意義。 4．氧代謝試驗 增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代謝是藥物治療缺血心臟病的重要作用。方法除前面介紹的心肌耗氧量測定外，可同時選用小鼠常壓、低壓耐缺氧等實驗和指標(biāo)。 (四 )陽性對照藥 陽性對照藥既可選擇西藥，也可選中藥。西藥作用明確，療效肯定，尤其是一些經(jīng)典藥品，可檢驗實驗方法可靠性。西藥劑量與中藥量相差較大，作用特點亦不大相同，不做藥效強度比較。采用中藥陽性藥時，一股應(yīng)選療效肯定的功能主治相似的中成藥對照，對照藥應(yīng)是藥典記載或經(jīng)衛(wèi)生部批準(zhǔn)生產(chǎn)的；對照藥劑應(yīng)與受試藥等效或相當(dāng)，以便進行比較，同一受試藥的不同藥效學(xué)實驗選用不同的陽性對照藥。 三、動物模型建立方法 (一 )犬或小型豬心肌缺血及心肌梗死模型 1．原理 通過縮窄或完全閉塞冠狀動脈，減少或停止供應(yīng)區(qū)的血流，形成心肌缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂，以致發(fā)生心肌壞死。 2．方法 健康成年犬或小豬 (現(xiàn)我國已培育出實驗用“中國實驗小型豬” )，雌雄兼用，體重 10— 15kg，經(jīng)戊巴比妥鈉 (30mg/kg)靜脈麻醉，手術(shù)臺固定，分離氣骨并插管，連接電動呼吸機，調(diào)節(jié)潮氣量 300— 600wi，動脈氧分壓維持在 12— 13kPa(90100mmHg)，血 pH在正常范圍；左側(cè)第四肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，做心包床；分離冠狀動脈左前降支中段 (一般相當(dāng)廠第三分支根部 )，可用以下兒種方法阻斷冠狀動脈，形成心肌缺血： (1)冠狀動脈結(jié)扎法：在冠脈分離處穿 3— 4號處線以備結(jié)扎，或用動脈夾阻斷，一般用于急性心肌缺血實驗。 (2)冠狀動脈血栓形成法：將弧型針狀電極 (刺激電極 )置于分離的冠狀動脈下，另一電極 (參考電極 )距刺激電極 o． 6mm處置于心外膜下，兩電極分別連接電刺激儀的隔離器正負極，以 2． lmA直流電刺激冠狀動脈30min左右，冠狀動脈內(nèi)血栓形成，阻斷冠狀動脈血流，誘發(fā)心肌缺血。 (3)冠狀動脈氣囊壓迫法：壓迫環(huán)由有機玻璃外套和可膨脹的乳膠小囊構(gòu)成，外套長 5mm側(cè)面 lmm的縫隙，血管由此進入肺內(nèi)，小囊長 3— 4mm，一端密閉，一端與塑料管相連，充滿蒸餾水或生理鹽水，經(jīng)塑料管注水 30— 40ul使小囊膨脹以壓迫套內(nèi)的血管，當(dāng)壓力去除時，小囊恢復(fù)原狀，冠狀動脈重新通暢，適用于急性和慢性心肌缺血或再灌實驗。 (4)Ameroid縮窄環(huán)法：為形成慢性冠狀動脈閉塞、心肌缺血或觀察冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的變化，用具有吸水性的塑料環(huán) (Ameroid環(huán) )套在冠狀動脈左旋支根部。關(guān)閉胸腔后，塑料環(huán)吸收組織水分膨脹，環(huán)外殼系硬質(zhì)材料做成，限制環(huán)的外展，結(jié)果壓迫冠狀動脈，形成心肌缺血。環(huán)植人 4— 6星期，血骨內(nèi)徑縮小 80％ 90％。 (5)清醒動物心肌缺血實驗：將氣囊壓迫環(huán)固定在冠狀動脈適當(dāng)部位，縫合心包，放置心包膜電極，氣囊的導(dǎo)管電極的導(dǎo)線分別穿過胸壁引出皮外，逐層縫閉胸。實驗時注入蒸餾水，使氣囊膨脹，壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，測量心外膜電圖或其他觀察指標(biāo) ,本法可反復(fù)阻斷冠狀動脈，進行多次清醒動物的心肌缺血實驗及再灌注損傷實驗。 (6)缺血再灌注創(chuàng)傷：在心肌缺血一定時間造成心肌損傷后，冉供血一定時間，加重心肌損傷而形成再灌注損傷，觀察藥物的保護作用。 3．藥物療效判斷 (1)心外膜電圖標(biāo)測：心外膜標(biāo)測點的定位應(yīng)包括缺血中心區(qū)、邊緣區(qū)和非缺血區(qū)，標(biāo)測方法：將心電極固定于具有一定彈性的無刺激性材料作成的片子上，該片四角縫于心外膜，如多點固定式心外膜電極?；蛑苯訉⒚總€電極固定于心外膜表面，或用一個燈芯電極按順序點測標(biāo)測點。或用一個電極沿心表山一定途徑移，記出一個連續(xù)的心外膜電曲線。電極用浸泡生理鹽水的燭芯棉線或細毛筆尖等柔軟材料探查電極，聯(lián)于心電圖胸前導(dǎo)聯(lián)描記，用普通心電圖機或多導(dǎo)生理記錄儀記錄。確定心肌缺血以 ST段抬高作為指標(biāo)，以 ST段抬高 ≥2mv的點數(shù)(N— ST)代表心肌缺血的范圍，以各點段抬高的毫伏數(shù)之和 (∑— ST)代表心肌缺血的程度。記錄阻斷冠脈血流前后的變化及藥物的影響。 (2)缺血區(qū)及梗死區(qū)面積的測定：在阻斷冠狀動脈血流孔后，經(jīng)左心耳根部向心房注人碳索墨水 1． 5ml／ kg， 2030s注完，迅速取下心臟，冰凍 30— 40min，在冠狀動脈結(jié)扎線下．平行冠狀溝等厚度將心室部分橫切成 5片，分別稱重，再用求積儀或電腦圖分析儀測量每片心肌兩面的墨水染色區(qū)與末染區(qū) (缺血區(qū) )，計算心肌缺血范圍的重量及百分比。然后將 5片心肌置硝基四氮唑藍 (N— BT)染液中，震搖染色 15min后取出，正常心肌染為暗藍色，梗死區(qū)心肌則小著色或淺黃色，用求積儀或落點求積法或電腦圖像分析法測量每片心肌兩面的梗死區(qū)和非梗死區(qū)，計算出每片心肌總面積、總重量；缺血區(qū)和梗死面積和重量；計算缺血區(qū)占心室百分比，梗死區(qū)占心空白分比，及梗死區(qū)占缺血區(qū)百分比，以評價藥物的療效。 (3)生化指標(biāo)：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測量血中乳酸脫氫酶的變化，分析心肌損傷情況。為避免具他肌肉組織釋放的酶干擾，測同工酶。 同時可測定血 ATP、 cAMP／ cGMP、無機離子、代謝物、能量代謝物質(zhì)等，如需了解藥物作用與前列腺素的關(guān)系，可觀察 PGl2或代謝產(chǎn)物的變化，以觀察藥物對的影響。如需了解藥物與氧自由基的關(guān)系，可測定超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)作為氧自由基產(chǎn)生和清除的觀測指標(biāo)。 (4)血液流變性指標(biāo)測定：阻斷冠狀動脈前后定時抽取血液，測定全血黏度、血漿纖維蛋白原含量、血細胞比容、紅細胞沉降率、血小板黏附和聚集性等血液流變學(xué)指標(biāo)。 4 注意點 犬和小型豬是建立心肌缺血模型最常用的動物，其體積大小適中，性情溫順、易訓(xùn)練、心臟解剖及生理特點與人相似，其影響因素有： (1)動物冠狀動脈分支及側(cè)支循環(huán)有個體差異，對分支及側(cè)支變異大的，不合標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)剔除不用，各組動物模型心肌缺血程度和范圍接近。 (2)正式實驗之前應(yīng)熟練掌握動物開胸手術(shù)和冠狀動脈分離手術(shù)，盡量減少出血，做心包床時，心肌不應(yīng)移位而影響心臟的正常舒縮功能。 (3)實驗時應(yīng)嚴(yán)格控制心外膜電極的位置、壓力，心臟表面的溫度、濕度及位置。心外膜電極放置的位置，或反復(fù)測定的位置應(yīng)準(zhǔn)確固定，不應(yīng)移位。電極不可對心臟壓力過大，心臟表