【正文】 結(jié)果。一般采用阻斷局部冠狀動脈血流一定時間，然后恢復(fù)冠脈血流，形成再灌注損傷。將自然沉淀的組織塊反復(fù)消化數(shù)次，直至完全分散為止。②不適于觀察不溶于水或含雜質(zhì)的粗制藥物，或非直接作用心肌細胞的藥物的作用。大鼠、豚鼠和犬每日皮下注射異丙腎上腺素 2— 8mg／ kg，家兔 10— 16mg/kg連續(xù)兩日，第一次和第二次紿異丙腎上腺素后 30min內(nèi)，每隔 5min記錄心電圖一次，第二次給藥后 24h記錄心電圖后殺死動物，取心臟做病理切片檢查。因此，心臟血流動力學指標應(yīng)作為主要藥效學研 究內(nèi)容。為了解藥物對缺血區(qū)心肌實際供血情況，可在整體實驗動物中進行冠脈側(cè)支循環(huán)、心肌區(qū)域血流量、心肌營養(yǎng)血流的研究，從不同角度反映藥物對冠脈循環(huán)的影響及防治心肌缺血的療效。 注意事項：本法研究藥物對犬或貓的冠狀靜脈竇流出量、心肌耗氧量的影響，簡單方便，作為初篩抗心絞痛藥物，能從供血與耗氧兩力面來評價。 根據(jù)阻斷冠脈前后心肌組織內(nèi)血流量的變化．減少 25％以上者為缺血，減少大于 75％者為嚴重缺血區(qū)。左心室心肌耗氧量為每分鐘8— 10ml／ 100g(心肌 )，工作負荷增加時每分鐘可達 40ml／100g(心肌 )。①離體心臟灌流耐缺氧實驗，用不同程度的低氧或無氧流液灌流離體心臟，觀察心臟功能、形態(tài)及生化指標的變化，可反映離體心臟對不同缺氧程度的耐受能力以及藥物的影響，并可用于受體作用的研究，但易受體外環(huán)境的影響，須嚴格擰制實驗條件。藥前及藥后不同時間抽取血樣進行血氧測定，與其他血流動力學指標同時紀錄相比較。 (4)小鼠低壓耐缺氧實驗法，本法與常壓耐缺氧實驗法相似，但將小鼠放入密封的低壓容器內(nèi)?？蛇x用犬、貓、小型豬等。 3．根據(jù)不同休克動物模型，增加有關(guān)病因的試驗 (1)治療邪毒內(nèi)陷之脫證的藥物：除進行上述有關(guān)休克模型外，還做①祛邪相關(guān)的試驗，如抑苗、抗病毒、對抗毒索、抗炎、解熱等試驗。 (二 )感染性休克模型 1．原理 內(nèi)毒素是細菌重要的致病因子之一，在微量時引起發(fā)熱，大量進入血液則引起循環(huán)衰竭造成厥脫證而致死亡。頸外靜脈插入高敏感度壓力換能器達右心房測中心靜脈壓(CVP)，左股動脈測平均動脈壓。三組動物血樣時間均相等。其余條件均同給藥組?，F(xiàn)代醫(yī)學抗心律失常的藥物主要分為四類：鈉通道阻斷劑，它主要抑制內(nèi)向快速除極，鈉流動，從而延長動作電位上升速度，主要分為三個亞類： In除極作用中等，而復(fù)極延長，如奎尼丁、普魯卡因酰胺、雙異丙腎上腺素等； Ib兼有促進 K外流作用，除極作用弱，復(fù)極作用縮短 (對 P— R、 QPS、 QT無影響 )，如利多卡因、美西律、妥卡尼、苯妥英鈉； lc除極作用強，復(fù)極作用甚小，如普羅帕酮、氟卡胺、Lorinine等。④弧心苷誘發(fā)的心律失常。大動物 (狗、猴、豬 )心室纖顫很難自然恢復(fù)，研究病因狗最適宜，豬的冠狀血管系統(tǒng)與人相似，現(xiàn)在越來越多地采用小豬以冠狀動脈結(jié)扎的方法形成心律失常。 2．方法 ①貓雌雄不拘，體重 2— 3kg，戊巴比妥 (3545mg／ kg)腹腔注射麻醉，氣管插管，接人工呼吸，開胸腔，切開心包膜，將作電極用的鋼制小夾分別置于心尖部和右心室底部 (或心尖部左側(cè)房室交界處 )或用雙極分別插在左室及心耳進行連續(xù)刺激，刺激參數(shù)為波寬 1mm，頻率 20Hz，當電流強度為0． 25mA時引起早搏， 1． 5mA引起室性心動過速， 1． 8mA引起室性過速和撲動， 2. 5mA引起室性纖顫。電生理實驗證明烏頭堿能加速心肌細胞 Na內(nèi)流，促進細胞膜去極化，誘發(fā)異位節(jié)律點，縮短不應(yīng)期，而導致心律失常，由于烏頭堿誘發(fā)的心律失常較持久，可以實驗治療，也可以預(yù)防給藥。皮下注射水合氯醛 0． 2g／ kg麻醉，背位固定手術(shù)臺記錄正常 ECG。 2．方法 小鼠，雌雄各半，分組；給待測藥物，一定時間將小鼠放入倒扣的 500ml燒杯中，其內(nèi)放入浸有 3ml氯仿的人棉球 (以后每換 1只鼠加0． 5ml)。 受試藥給藥方法中至少有一種與臨床相同。②房顫或室顫發(fā)生率和死亡率。腎上腺素興奮受體，心臟自律性、傳導性、應(yīng)激性及心率提高，誘發(fā)室性心律失常，②氯仿誘發(fā)小鼠的心室纖顫。心律失常同時涉及心臟電活動和機械性搏動的節(jié)律，但雖明顯最精確地從心臟電活動的改變中反映出來，因此心電圖是反映心律的最重要最直接的指標。通過塑料三通左頸總動脈取血，分別測定夾閉前、松夾后 1h、 2h三個時間的全血谷胱肽過氧化物酶活力。 (5)多巴胺 (DOP)是公認的治療心源性休克有效藥物之一，能明顯改善本休克模型心肌收縮性能與心肌供血，升高血壓等。 2 ．操作方法 用犬以戊巴比妥鈉 25mg／ kg靜脈注射麻醉，分離股動脈與股靜脈，靜脈插管連接二通，一側(cè)供輸液，一側(cè)供給藥。觀察血壓、呼吸、心電圖、最大放血量、存活率等。氣血兩脫，由急性失血引起，即失血亡陰之脫證，用失血性休克代償期和失代償早期作為氣血兩脫證的動物模型，如為失代償晚期，屬陰陽俱脫證。 二、藥效學研究的實驗設(shè)計 (一 )對厥脫證動物模型的治療作用試驗 1．常用動物模型 (1)失血性休克模型：用動脈急性放血的方法，急性失血達總血量的 15％ — 20％時，就發(fā)生休克，待血壓降至 5． 3kPa時便達到難逆性克?？捎貌ＡЦ稍锲鞔鎻V口瓶。 下面重點介紹幾種常用方法。 2 間接測定 ①張力 — 時間指數(shù)，根據(jù)心肌耗氧量與心臟做功有密切關(guān)系的原理，間接推測心肌耗氧量的變化。藥物抑制心肌收縮力，可使血管阻力降低．冠脈流量增加，假陽性。 區(qū)域性心肌血流量的操作方法是用羰化塑料微球懸于含 o． 01％吐慍 80的生理鹽水內(nèi)，使用的置旋渦混合器 I— 2min，取微球 500萬，用生理鹽水稀釋到l0ml， 10s內(nèi)注入麻醉開胸犬左房導管，再用 10ml鹽水沖洗導管：注射微球的同時用恒速泵以 67ml／ min的速度從插人動脈弓的導管連續(xù)取 3份參考樣品，每份 40s。停灌后 10 min，分別記錄心輸出量、冠脈反流量及反流壓，動脈壓及心率，作為給藥前對照值，然后給予實驗藥物。 (七 )冠脈循環(huán)實驗 1．原理 冠脈流量是評價防治心肌缺血藥物的重要指標。 (4)注意事項：本實驗特點是不開胸，不結(jié)扎冠狀動脈，通過心電圖、血流動力學、生化 和病理研究以評價抗心肌缺血藥的治療作用。 判定指標同大鼠。 4．方法學評價 優(yōu)點：①觀察藥物對心肌細胞的直接作用，可排除藥物通過其他間接影響心肌缺血氧的作用。心肌細胞缺氧缺糖后，功能從形態(tài)有明顯改變，如胞漿泡形成，胞漿顆粒增加出現(xiàn)異形心肌細胞等；經(jīng)活體染色證實細胞死亡數(shù)增加；搏動頻率下降，動作電位改變；胞漿的乳酸脫氫酶，羥酸脫氫酶及磷酸肌酸肌酶大量漏出等、可利用這些指標評定藥物對心肌細胞缺血樣損傷的保護作用。 (三 )心肌缺血再灌注損傷模型 1．原理 心肌經(jīng)一定時間缺血 (缺氧 )后，突然恢復(fù)血 (氧 )供，形成更嚴重損傷，即“心肌缺血再灌注損傷”，其形成原因可能是心肌恢復(fù)血流時，加速細胞膜內(nèi)外的鈉鈣交換，大量鈣離子進人細胞內(nèi)，形成“鈣超載”：心肌細胞發(fā)生“拘縮”而喪失功能。心外膜電極放置的位置，或反復(fù)測定的位置應(yīng)準確固定，不應(yīng)移位。 3．藥物療效判斷 (1)心外膜電圖標測：心外膜標測點的定位應(yīng)包括缺血中心區(qū)、邊緣區(qū)和非缺血區(qū)，標測方法：將心電極固定于具有一定彈性的無刺激性材料作成的片子上，該片四角縫于心外膜，如多點固定式心外膜電極。 4．氧代謝試驗 增加心肌的供氧和提高心肌的耐缺氧能力，改善心肌能量代謝是藥物治療缺血心臟病的重要作用。應(yīng)作為新藥主要藥效學的首選試驗。染色或 TIC染色或雙重染色 )觀察心肌梗死面積的改變。本虛以臟氣虧虛為主．可兼陰虛；標實以血瘀痰阻多見，可兼氣滯、寒凝。 (2)藥物誘發(fā)心肌缺血模型：通過藥物誘發(fā)冠脈痙攣法，如垂體后葉素、麥角新堿，以及通過增加心肌耗氧法，如異丙腎亡腺素等。③放射自顯影法觀察缺血區(qū)。以三磷酸腺稈、花生四烯酸 (AA)、膠原、凝血酶等作為繡導劑，應(yīng)用比濁法或其他方法測定。 (3)冠狀動脈氣囊壓迫法：壓迫環(huán)由有機玻璃外套和可膨脹的乳膠小囊構(gòu)成，外套長 5mm側(cè)面 lmm的縫隙，血管由此進入肺內(nèi)，小囊長 3— 4mm，一端密閉，一端與塑料管相連，充滿蒸餾水或生理鹽水，經(jīng)塑料管注水 30— 40ul使小囊膨脹以壓迫套內(nèi)的血管，當壓力去除時，小囊恢復(fù)原狀，冠狀動脈重新通暢，適用于急性和慢性心肌缺血或再灌實驗。為避免具他肌肉組織釋放的酶干擾，測同工酶。 3 測定指標 (1)心電圖 ST段及 Q波標測：記錄標準導聯(lián)心電圖及胸前導聯(lián)心電圖，測 ∑— ST、病理性 Q波、嚴重心律失常等指標。②缺血期，以 00號線于左心耳部下力進針，從肺動脈圓錐旁穿出，結(jié)扎冠狀動脈 10min。也可在缺氧后再供氧，形成冉供氧損傷，開觀察藥物對供氧損傷的影響。 (2)方法： 大鼠缺血模型：取體重 200g健康大鼠，腹腔注射烏拉坦麻醉，仰臥固定，將電極插入四肢及胸前心尖搏動處皮下，調(diào)節(jié)心電圖靈敏度 1mV=15mm，紙速為50mm/s，可璉接心電示波器連續(xù)觀察心電變化，記錄胸前導聯(lián)或?qū)?lián)心電圖。 3．麥角新堿誘發(fā)心肌缺血模型 (1)原理：動物左冠狀動脈干注入麥角新堿，可誘發(fā)明顯的冠狀動脈痙攣 和血流動力學改變：平均動脈壓、冠脈壓和肺動脈壓及外周阻力增加，心排出量下降，乙電圖 STT抬高， 60％發(fā)生室性心律失常，左冠狀動脈造影顯示狹窄率達 50％ — 75％，動脈血氧下 降，血小板聚集和血拴烷增加，前列腺環(huán)素下降，顯示急性心肌缺血缺氧全身高凝狀態(tài) 的病理生理改變：、病理學證實，心肌有缺血壞死性改變及冠脈血栓形成。頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇，動脈插管，以血氧測定儀或血氣分析儀分別測定冠狀靜脈血氧含量及動脈血氧含量，計算心肌耗氧量。放相應(yīng)直徑電磁流量計探頭．測量心輸出量。 方法：取體重 24g的健康小鼠分組，給藥或?qū)φ账幒蟾粢欢〞r間，根據(jù)待試藥物的藥代動力學過程確定，從尾靜脈注射 RbCl生理鹽水溶液o． 1ml(4000— 10000脈沖／ min)， 5s注入，注射后 30s，立即處死動物，取心臟，用生理鹽水沖洗 4次，每次 l0ml。心臟表面放置鉑電極，連接電刺激，用于心臟起搏。②心肌氧張力測定，極譜儀的鉑電極插入丌胸犬的心肌，連續(xù)紀錄心肌氧張力的變化。④其他，小鼠常壓或減壓缺氧實驗，方法簡單，應(yīng)用廣，反映整體 (特別是腦組織 )的耐缺氧能力，但特異性差，不能反映心肌的耐缺氧力，易受鎮(zhèn)靜、催眠或刺激性藥物的影響，出現(xiàn)假陽性。 方法：大鼠或家兔隨機分組，給藥或?qū)φ找汉?，分別測定心肌耗氧量或結(jié)扎冠狀動脈形成心肌缺血。厥脫證分為寒厥證、熱厥證、陰脫證，陽脫證、氣血兩脫和陰陽俱脫證等。 (6)腸系膜上動脈夾閉性休克模型：夾閉腸系膜上動脈，引起腸道缺血，當一段時間后，恢復(fù)血液供應(yīng)，此時即引起休克。 4．其他 還有重要臟器血流量如腦、腎及冠狀動脈血流量的測定、自由基測定及各種酶的測定、電鏡微觀結(jié)構(gòu)觀察等對闡明厥脫證藥物的機制是必需的。 4．注意點 (1)實驗用大腸桿菌內(nèi)毒素可由干燥大腸艾希菌制備，經(jīng)毒力測定后封裝在安缽內(nèi)，保存?zhèn)溆?。?MAP下降至 9． 3kPa或原血壓 (1013kPa)的 70％以下者視為休克。 (五 )腸系膜上動脈夾閉性 (sMAO)休克模型 1 原理 休克的發(fā)生可能與腸道缺血再灌注時自由基及其他多種毒物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。用無創(chuàng)傷動脈夾閉要完全。受試中藥的其他相關(guān)藥效作用如補益、理氣等，可根據(jù)受試物的情況而增加。鈣增加能降低蒲氏纖維的興奮性顯著增加普通心肌的去極化，導致局部傳導阻滯，并增加沖動擴散的不齊。 (5)當心律失常持續(xù)叫間較短，無法進行實驗治療時，采取先行給藥物，再造成心 律失常，在同樣條件下，比較對照組與給藥組形成心律失常的時間、程度、持續(xù)時間或誘發(fā)心律失常所用化學物質(zhì)的劑量等，這可視為預(yù)防給藥的保護作用。再灌注期間尤其是再灌注即刻至 3min內(nèi)出現(xiàn)病理性 Q波，室性早搏和心動過速。毒毛旋花苷 G對心臟的毒性表現(xiàn)為室性早搏 (VP)、室性心動過速 (VT)、心室顫動 (VF)、心肌停搏 (CA)。做肌靜脈插管，一側(cè)與恒速輸液泵相連，準備恒速注射毒毛旋花苷 G每分鐘1ug／ 100g(體重 )，另側(cè)給治療藥物或等容量的生理鹽水，靜脈注射 3min后，開恒速泵，每分鐘或必要時 (心電圖變化明顯或心臟將要停跳前 )記錄心電圖至心跳停止。 2．方法 大鼠戊巴比妥鈉 50mg／ kg皮下注射麻醉，用動物人工呼吸機作人工呼吸，通氣量為 250ml／ min，于左前胸 4— 5肋間開胸，輕壓胸廓擠出心臟，于肺動脈圓錐左緣，左心耳下沿用無損傷縫合針 2或 0號滌綸線縫于冠脈左前降支下，把心臟放回胸腔，靜脈注射生理鹽水或受試藥物后 5min，將自徑為 3mm長 5mm的橡膠管與冠狀動脈左前降支結(jié)扎，造成心肌缺血。 (二 )其他試驗 1 離體豚鼠右心室乳頭肌實驗 離體豚鼠右室乳頭肌標本固定在改良臺氏液灌流槽