【正文】 Primer R PCR 長(zhǎng)的擴(kuò)增片段 無(wú)擴(kuò)增片段 外顯子 1 外顯子 2 外顯子 3 內(nèi)含子 2 內(nèi)含子 1 Total RNA中 Genomic DNA混入的對(duì)策 引物設(shè)計(jì)可以避免基因組 DNA來(lái)源的 Template擴(kuò)增 生物秀 — 專心做生物！ 目的是獲得目的基因，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴(yán)格。 目的是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴(yán)格。 Real Time PCR用引物與普通 PCR引物設(shè)計(jì)要求不同 = 對(duì)引物設(shè)計(jì)要求嚴(yán)格 普通 PCR引物 Real Time PCR引物 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 擴(kuò)增片段大小 ★ 80150bp(盡量限制在 300bp以內(nèi) ) Primer長(zhǎng)度 ★ 1725base GC含量 ★ 4060%(最好 4555%) Tm值 ★ ★ ★ 兩條引物的 Tm值盡量接近，引用專用軟件計(jì)算 Tm值 序列 ★ 整體上堿基不能過(guò)偏 個(gè)別部分避免 GC rich或 AT rich(特別是 3’端 ) 避免 T/C連續(xù)， A/G連續(xù) 3’末端序列 ★ 3’末端避免 GC rich或 AT rich 3’末端堿基最好為 G 或 C 3’末端堿基盡量避免為 T 互補(bǔ)性 ★ ★ ★ 引物內(nèi)部或兩條引物之間避免 3base以上的互補(bǔ)序列 引物 3’末端避免 2base以上的互補(bǔ)序列 特異性 ★ ★ ★ 使用 BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性 RTPCR用引物 ★★ 盡量在 Exon junction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組 DNA擴(kuò)增 Real Time PCR用引物設(shè)計(jì)原則 ★ 號(hào)表示重要程度， ★ 號(hào)越多，表示該參數(shù)越重要，設(shè)計(jì)時(shí)要優(yōu)先考慮 生物秀 — 專心做生物！ 目的基因序列獲得 好的引物 需要尋找好的參照序列 引物設(shè)計(jì) 分析序列 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) RefSeq序列 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ （ 通過(guò) NCBI獲得參考序列和相關(guān)情報(bào)。RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)提供無(wú)重復(fù)，準(zhǔn)確性，完整性的基因參考序列。 序列可信度高，信息量大 NCBI: The National Center for Biotechnology Information NM_008777 RefSeq 評(píng)價(jià) Pah Pah Pah Pah X51942 BC013458 BI330290 BF789560 X51942 BC013458 BI330290 BF789560 Pah Pah GenBank Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ NCBI提供目的基因相關(guān)信息 （ 基因名 、 染色體上的位置 、 Accession、表 現(xiàn) 型、 文獻(xiàn)索引 、 同源性等其他數(shù)據(jù)庫(kù)以及功能 、 pass way、 蛋白質(zhì)圖譜等 ） 基因詞典 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) 生物秀 — 專心做生物！ LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15APR2022 DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. ACCESSION NM_008777 VERSION GI:6679202 SOURCE Mus musculus (house mouse) ORGANISM Mus musculus FEATURES Location/Qualifiers gene 1..1959 /gene=Pah /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48..1409 /gene=Pah /note=go_function: iron ion binding [goid 0005506] /protein_id= /db_xref=GI:6679203 /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt GenBank file NM_008777 Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA. 目的基因序列獲得 引物設(shè)計(jì) 序列分析 特異性確認(rèn) 基因組序列確認(rèn) 目的基因 Real Time PCR引物及探針設(shè)計(jì) Real Time RTPCR 引物 生物秀 — 專心做生物！ 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct