db21t 18612-20xx 水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性法-文庫(kù)吧
2025-03-23 03:03 本頁(yè)面
【正文】 限制性?xún)?nèi)切酶酶切成大小不等的片段，并與含有粘性末端的人工接頭相連，形成酶切位點(diǎn)不同的限制性酶切片段，然后用與接頭和位點(diǎn)相匹配的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步PCR擴(kuò)增的模板，再選用特異引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳將特異的限制性片段分離。由于不同來(lái)源DNA的酶切片段存在差異，因而產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)。5 試劑 三羥甲基氨基甲烷（Tris）飽和酚。 三氯甲烷：分析純。 異戊醇：分析純。 無(wú)水乙醇：分析純。 20TBE緩沖液：三羥甲基氨基甲烷121g，EDTA ，加超純水到1L。 冰乙酸：分析純。 瓊脂糖：生化試劑。 核糖核酸（RNA）酶：生化試劑。 蛋白酶K（20 mg/mL）：生化試劑。 丙烯酰胺：分析純。 甲叉雙丙烯酰胺：分析純。 過(guò)硫酸銨：分析純。 硝酸銀（AgNO3）：分析純。 四甲基乙二胺（TEMED）：分析純。 無(wú)水碳酸鈉：分析純。 Taq DNA聚合酶（生化試劑，5 U/mL）。 標(biāo)準(zhǔn)分子量Markers（100bp）。 硝酸：分析純。 37%甲醛溶液。 乙二胺四乙酸（EDTA）：分析純。 限制性?xún)?nèi)切酶： EcoRⅠ、MseⅠ。 20%變性凝膠儲(chǔ)存液：，尿素86g，20TBE緩沖液10mL，加熱溶解，超純水定容到200mL后，放置棕色瓶中4℃保存。 上樣緩沖液：98％甲酰胺，10mM EDTA()，％溴酚藍(lán)及二甲苯青。 ： 硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）溶于100 ml 超純水中。 銀染液：1g硝酸銀溶于1L超純水中，加入37%。：3g碳酸鈉溶于超純水中，加入37%。6 儀器和設(shè)備 凝膠成像分析系統(tǒng)。 梯度PCR儀。 低溫高速離心機(jī)。 普通離心機(jī)。 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。 單道可調(diào)移液器（ mL，10 mL，20 mL，100 mL，200 mL，1000 mL）。 電子天平（ mg）。 水浴恒溫震蕩器。 電泳槽。 冷凍離心機(jī)。 紫外分光光度計(jì)。 超聲波清洗器。 超純水器。 北京六一儀器廠(chǎng)DYYⅢ型電泳儀。 測(cè)序凝膠電泳槽。7 采樣 樣品類(lèi)型 I型樣品：毛發(fā)、皮毛類(lèi)（儒艮、中華白海豚、斑海豹、海龜）。 Ⅱ型樣品：肌肉、臟器組織類(lèi)（仿刺參、海膽、虹鱒、大菱鲆、鰻鱺、中國(guó)對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、中華絨鰲蟹、三疣梭子蟹、皺紋盤(pán)鮑、海灣扇貝、蝦夷扇貝、櫛孔扇貝、文蛤、牡蠣、海蜇等）。 III型樣品：藻類(lèi)（海帶、裙帶菜、鼠尾藻等）。 采樣方法應(yīng)在自然保護(hù)機(jī)構(gòu)、人工養(yǎng)殖部門(mén)等協(xié)助下進(jìn)行，以不傷害個(gè)體、不破壞其生境為原則，采集其毛發(fā)、皮毛等作為樣品，特殊情況（如出現(xiàn)受傷個(gè)體等）可酌情采取其他部位（如肌肉、肝臟等）。樣品數(shù)量應(yīng)不少于10個(gè)/群體。所采樣品標(biāo)注后，妥善存放，防止污損，做好采樣記錄。隨機(jī)采取正常、健康個(gè)體樣品，數(shù)量不少于30個(gè)/群體。樣品標(biāo)注后，活體運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。8 分析步驟 樣品固定 Ⅰ型樣品將樣品先用70%乙醇洗1次，再用超純
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