db21t18612-20xx水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(更新版)
【正文】 1 min.72℃（延伸）1 min.72℃（終了延伸）5 min.選擇擴(kuò)增引物序列見(jiàn)附錄C，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10100倍作為選擴(kuò)增模板，按表5配制選擴(kuò)增體系，按表6進(jìn)行PCR反應(yīng)。L)MseⅠ 接頭(2PM/181。l5181。按表1配制酶切體系，每40181。 DNA濃度檢測(cè)分別于260 nm波長(zhǎng)和280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定產(chǎn)物（或產(chǎn)物稀釋液）的紫外吸收值。振蕩均勻后，65℃水浴1h；按GB/T ，用苯酚和氯仿方法抽提DNA；用50 181。樣品標(biāo)注后，活體運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。 測(cè)序凝膠電泳槽。 電子天平（ mg）。 銀染液：1g硝酸銀溶于1L超純水中，加入37%。 標(biāo)準(zhǔn)分子量Markers（100bp）。 蛋白酶K（20 mg/mL）：生化試劑。5 試劑 三羥甲基氨基甲烷（Tris）飽和酚。多態(tài)性位點(diǎn)百分率 (Percent of Polymaorphic Loci，P) 表示后代所獲得某個(gè)等位標(biāo)記來(lái)自于它的父親（或母親）的同一個(gè)等位標(biāo)記的可能性。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。B50DB21遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 21/ ?—2010水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性法AFLP procedure to detect germplasm for aquaculture species2010 12 31發(fā)布2011 02 01實(shí)施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB21/ ?—2010前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。在一個(gè)群體中一個(gè)基因可能有許多等位基因。由于不同來(lái)源DNA的酶切片段存在差異，因而產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)。 核糖核酸（RNA）酶：生化試劑。 Taq DNA聚合酶（生化試劑，5 U/mL）。 ： 硫代硫酸鈉（Na2S2O3?5H2O）溶于100 ml 超純水中。 單道可調(diào)移液器（ mL，10 mL，20 mL，100 mL，200 mL，1000 mL）。 北京六一儀器廠DYYⅢ型電泳儀。隨機(jī)采取正常、健康個(gè)體樣品，數(shù)量不少于30個(gè)/群體。 Ⅱ型樣品取20℃，置于液氮中研成粉末；加DNA提取液(10mmol/L TrisHCl，pH ，75mmol/L NaCl，%SDS，5mmol/L EDTA)。以DNA條帶的分子量及有無(wú)拖尾為標(biāo)準(zhǔn)判斷DNA的質(zhì)量。 AFLP分析 限制性?xún)?nèi)切酶消化本規(guī)程統(tǒng)一采用EcoRⅠ/ MseⅠ雙酶切組合反應(yīng)體系。g/181。L）基因組DNA酶切液EcoRⅠ 接頭(2PM/181。l)dNTPs (5mM)10X PCR緩沖液Taq酶 (5U/181。將梳子背面插入膠液中，吸出多余膠液，室溫下聚合2h。（9）將上述膠板置于凝膠成像儀中，利用相關(guān)圖像采集系統(tǒng)得到清晰的電泳凝膠圖像，用于結(jié)果分析。3180。MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物：518
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