db21t18612-20xx水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗技術規(guī)程擴增片段長度多態(tài)性法-文庫吧在線文庫
【正文】 將研究對象分為相對同質(zhì)的群組（clusters）的統(tǒng)計分析技術。 冰乙酸：分析純。 四甲基乙二胺（TEMED）：分析純。 20%變性凝膠儲存液：，尿素86g，20TBE緩沖液10mL，加熱溶解，超純水定容到200mL后，放置棕色瓶中4℃保存。 普通離心機。 超聲波清洗器。樣品數(shù)量應不少于10個/群體。毛囊裂解液用1PCR緩沖液(50mmol/L KCl，10mmol/L TrisHCl，%明膠)，加MgCl2至2mmol/L，蛋白酶K 20mg/L；在PCR儀上設置一個單循環(huán)程序：65℃ 30min，95℃ 15min，4℃ 10min；將上一步驟中的離心管放入預熱好的PCR儀中，運行該程序。 DNA產(chǎn)物測定 DNA純度檢測吸取1~3 181?；蚪MDNA產(chǎn)物完成產(chǎn)物鑒定后，稀釋到100ng/181。l5UMseⅠ4U/181。接頭序列見附錄A 接頭連接（冰上操作）按表2配制連接體系，混勻，室溫下連接過夜。L)EcoRⅠ預擴增引物 (50ng/181。l)MgCl2 (25mM)超純水預擴增稀釋液總計20表6 選擇擴增反應條件94℃（初始變性）2 min94℃（變性）30 s12循環(huán)，℃65℃（退火）30 s72℃（延伸）1 min.94℃（變性）30 s23個循環(huán)56℃（退火）30 s72℃（延伸）1 min.72℃（終了延伸）2 min.（1）模具處理與安裝：清洗用作模具的玻璃板并晾干，并分別涂上親和硅烷（主板）和剝離硅烷（耳板），安裝好邊條并加緊模具。（7）電泳 采用恒恒功率電泳，至二甲苯青達凝膠的下2/3處，停止電泳。附錄A(資料性附錄)EcoRⅠ與MseⅠ接頭序列EcoRⅠ接頭：5180。附錄B(資料性附錄)EcoRⅠ與MseⅠ預擴增引物序列EcoRⅠ預擴增引物：5180。注：其中X代表任意一種堿基。附錄c(資料性附錄)EcoRⅠ與MseⅠ選擴增引物序列EcoRⅠ選擇擴增引物：5180。MseⅠ接頭：5180。在相同遷移位置，按每一個體擴增片段的有無，出現(xiàn)擴增帶記錄為1，無擴增帶記錄為0。（4）清洗上樣孔 關閉電源，用注射器吸取電泳緩沖液逐個清洗加樣孔。表5 選擇擴增反應體系試劑體積(181。L)T4 DNA 連接酶10X緩沖液T4 DNA 連接酶 (3U/181。g超純水————基因組DNA50ng/181。L體系中加入DNA 10181。確定A260／~，方可正常進行后續(xù)實驗。L TE緩沖液（10mmol/L TrisHCl pH ，lmmol/L EDTA）溶解DNA，20℃保存。8 分析步驟 樣品固定 Ⅰ型樣品將樣品先用70%乙醇洗1次，再用超純水沖洗2次，20℃保存?zhèn)溆谩? 采樣 樣品類型 I型樣品：毛發(fā)、皮毛類（儒艮、中華白海豚、斑海豹、
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