db21t18612-20xx水產(chǎn)生物種質(zhì)檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(完整版)
【正文】 海龜）。 水浴恒溫震蕩器。：3g碳酸鈉溶于超純水中，加入37%。 硝酸：分析純。 丙烯酰胺：分析純。 三氯甲烷：分析純。 Nei’s 基因多樣性指數(shù)（Gene Diversity，H）隨機(jī)選擇基因間的非同一的概率。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)生物種質(zhì)檢測(cè)與鑒定等方面的種質(zhì)檢驗(yàn)工作。 等位基因（Allele）基因的一種變異體，在二倍體細(xì)胞內(nèi)每個(gè)基因有兩個(gè)等位基因，每個(gè)等位基因分別來自于各自的親本。4 原理擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性法（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）的原理是對(duì)基因組總DNA酶切后經(jīng)PCR進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，先將基因組DNA用兩種限制性內(nèi)切酶酶切成大小不等的片段，并與含有粘性末端的人工接頭相連，形成酶切位點(diǎn)不同的限制性酶切片段，然后用與接頭和位點(diǎn)相匹配的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為進(jìn)一步PCR擴(kuò)增的模板，再選用特異引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳將特異的限制性片段分離。 瓊脂糖：生化試劑。 無水碳酸鈉：分析純。 上樣緩沖液：98％甲酰胺，10mM EDTA()，％溴酚藍(lán)及二甲苯青。 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。 超純水器。所采樣品標(biāo)注后，妥善存放，防止污損，做好采樣記錄。程序結(jié)束后，將離心管進(jìn)行瞬時(shí)離心，20℃保存?zhèn)溆?。L提取的DNA，用濃度1~2％瓊脂糖凝膠100V電泳 30 min，檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量。L備用。l5U乙酰化牛血清白蛋白10181。表2 接頭連接反應(yīng)體系試劑體積（181。l)MseⅠ預(yù)擴(kuò)增引物 (50ng/181。（2）6％變性聚丙烯酰胺凝膠制備：按表7配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠。（8）銀染 取下凝膠板，拆除耳板和邊條，將其置于10％冰醋酸中進(jìn)行固定，搖床上搖30min，將膠板轉(zhuǎn)入超純水中清洗3次，每次2min，將膠板置于銀染液中染30min，超純水沖洗5s后立即放入顯影液中，待條帶顯出后，用10％冰醋酸定影5min，自來水沖洗1min，晾干。 CTCGTAGACTGCGTACC3180。GACTGCGTACCAATTC 3180。_________________________________。GATGAGTCCTGAGTAA 3180。CTGACGCATGGTTAA5180。9 數(shù)據(jù)分析選擇電泳后清晰的擴(kuò)增片段進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。表7 6%聚丙烯酰胺變性凝膠配制藥品與試劑體積20％膠儲(chǔ)存液15mL超純水10％過硫酸銨TEMED總體積50mL（3）預(yù)電泳 凝膠聚合后，將梳子正向插入膠頂空處，形成加樣孔，連接好電泳設(shè)備，添加TBE電泳緩沖液。l)MgCl2 (25mM)超純水接頭連接液總計(jì)表4 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件94℃（初始變性）2 min94℃（變性）1 min26 個(gè)循環(huán)56℃（退火）
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