組化3第三章酶組化-文庫吧
2024-12-22 07:20 本頁面
【正文】 經(jīng)遞質(zhì)釋放過程。總之，在疾病、免疫反應(yīng)和細(xì)胞損傷與修復(fù)過程中 ACP均具有一定的生物學(xué)意義。 （二）反應(yīng)原理 顯示酸性磷酸酶，先將切片放入含有酶底物（ β甘油磷酸鈉 ）的溶液（）中孵育，底物經(jīng)酶水解，釋放磷酸，用捕捉劑硝酸鉛與磷酸反應(yīng)，形成微細(xì)的磷酸鉛，沉淀于酶存在的部位，再用硫化銨處理，磷酸鉛被置換形成粗顆粒狀的黑色硫化鉛沉淀物，便可用光鏡看到。 （三）光鏡顯示 ACP有鉛法和偶氮偶聯(lián)法： 鉛法： 1）孵育液的配制： , 10ml 蔗糖 g 硝酸鉛 Pb(NO3)2 10mg 3%(約 )β甘油磷酸鈉 1 ml 按上述順序加入 ,待硝酸鉛完全溶解后再逐滴 加入底物 ,邊加邊攪至溶液完全透明。 2) 染色步驟： ① 石蠟切片脫蠟到水；冰凍切片或冰凍切 片冷福爾馬林鈣固定 10 min后水洗； ② 入孵育液 2～ 4 h（肝組織 1 h左右）， 37℃ ； ③ 雙蒸餾水洗； ④ 入 1％硫化銨（新配）溶液內(nèi) 1～ 2 min ⑤ 流水洗。 1 3）對照： 在孵育液內(nèi)加入 mol/L氟化鈉 (NaF)抑制劑后 ,ACP 反應(yīng)呈陰性。 M 4）染色結(jié)果： ACP呈棕黑色硫化鉛顆粒。 5）說明： ACP是可溶性酶，以冷固定后結(jié)果 較滿 意 .石蠟切片制作過程易使酶 失活。 三 、 ５ ˊ－核苷酸酶 （ 一 ） 名稱 常用名： ５ ˊ－核苷酸酶 （ ５ ˊ－ Nucleotidase） ５ ˊ－核苷酸酶是一種特異性的磷酸單酯酶 ， 它能水解核糖核苷和去氧核糖核苷在Ｃ－ 5位置的磷酸酯 ， 如一磷酸腺苷 （ ＡＭＰ ） ， 一磷酸肌苷 （ ＩＭＰ ） ， 尿苷－磷酸（ UMP） ,胞苷－磷酸 （ ＣＭＰ ） 等 ， 水解產(chǎn)生核苷和磷酸 ， 但不能分解 223。－甘油磷酸 ，葡萄糖－６－磷酸 。 ５ ˊ－核苷酸酶是一種最適 pＨ值相當(dāng)廣泛的酶 。 （二）反應(yīng)原理 ? 底物經(jīng)酶水解，用金屬離子捕捉生成的磷酸離子而形成沉淀。即：腺苷－５ ˊ－磷酸＋水 腺苷＋磷酸。 （ 三 ） 光鏡顯示方法 鉛法 （ Wachs和 Meisel 1956） （ 1） 取材：新鮮組織冰凍切片 （ 2） 孵育液的配制： 腺苷－５ ˊ－磷酸鈉 4mg Tris蘋果酸緩沖液 （ Trismaleate buffer） pＨ 4ml MgSO4(%） 1ml 2%硝酸鉛 蒸餾水 （ 1）方法與步驟： ① 新鮮組織冰凍切片 ,或冷 10%福爾馬林 固定冰凍切片 。 ② 蒸餾水水洗 。 ③ 入孵育液 ,恒溫 37℃ ,孵育 20~60分鐘 。 ④ 自來水洗 。 ⑤ 入 1%硫化銨 1分鐘 。 ⑥ 蒸餾水沖洗 。 ⑦ 甘油明膠封固。 (4)結(jié)果與評價(jià) : 棕黑色
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1