【正文】 布。 次代培養(yǎng)及純化 ? 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見(jiàn)的菌落形態(tài)上的差異 ，作初步的鑒定和區(qū)分 。 ? 通過(guò)高倍放大進(jìn)行鏡檢 ， 可了解氣生和營(yíng)養(yǎng)孢子形成情況 。 ? 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同的生長(zhǎng)形態(tài) 、 從而初步地加以鑒定 ，在分離放線菌時(shí)顯得尤為重要 。 ? 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無(wú)菌牙簽挑取 ， 點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng) ， 以進(jìn)一步篩選和分離 。 六 、真菌分離 利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散 ， 利于計(jì)數(shù) ， 分離和鑒定 。 這里主要是利用營(yíng)養(yǎng)成分的減少而使生長(zhǎng)減慢 ， 并由此限制真菌的遷涉生長(zhǎng) 。 改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離 。 有時(shí) ， 真菌子實(shí)體形成必須有光線 ， 這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮 。 選擇性富集：是通過(guò)一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。 富集可以是種水平的，如通過(guò)營(yíng)養(yǎng)要求的改變來(lái)富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。 選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標(biāo)微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及菌落形成。 真菌的分離方法 ? 土中真菌的分離：稀釋法 ， 混入法 ， 壓貼法 ，粘附法 ， 浮選法 ， 注射器采集法 ， 土過(guò)篩法 ，庶糖密度梯度離心法 。 ? 植物材料中真菌的分離：植入法 ， 壓貼法 ， 洗滌法 ， 浸泡法 。 ? 水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離 。 餌誘技術(shù)常用于水中真菌的富集 。 ? 子實(shí)體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實(shí)體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無(wú)菌濾紙上培養(yǎng) 。 七、生產(chǎn)選種 ? 是在長(zhǎng)年累月的生產(chǎn)實(shí)踐中 ， 在培養(yǎng)工藝條件沒(méi)有任何可見(jiàn)變更情況下 ， 突然發(fā)現(xiàn)某些批次生產(chǎn)水平提高較大 ， 這就有可能是個(gè)別自然變異朝更好的方向變的細(xì)胞 ， 在這種條件下很適應(yīng)于培養(yǎng)條件 ， 并逐漸顯示出它的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì) ， 這種優(yōu)勢(shì)的發(fā)展 ， 促使它優(yōu)良的生產(chǎn)性能表露 。 進(jìn)行類(lèi)似新種篩選分離 ， 達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的 。 第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針 ? 工業(yè)菌種的育種： 是運(yùn)用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對(duì)某個(gè)用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造 。 通過(guò)改造 ， 可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化 ， 或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀 。 工業(yè)菌種育種的方法 ? 誘變 ? 基因轉(zhuǎn)移 ? 基因重組 育種過(guò)程 ? 包括下列 3個(gè)步驟： ? (1)在不影響菌種活力的前提下 ， 有益基因型的引入 。 ? (2)希望基因型的選出 。 ? (3)改良菌種的評(píng)價(jià) (包括實(shí)驗(yàn)規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模 )。 選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素 (1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系 (如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn) )； (2)對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬(wàn)面認(rèn)識(shí)的明了程度； (3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用 。 ? 如果對(duì)特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少 ，則多半采用隨機(jī)誘變 、 篩選及選育等技術(shù)： ? 如果對(duì)其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識(shí) ， 則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種 。 工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過(guò)代謝途徑中的限速步驟：通過(guò)增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來(lái)提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟 ， 由此提供一個(gè)旁路代謝途徑 。 (2)增加前體物的濃度 。 (3)改變代謝途徑 ， 減少無(wú)用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物 、 前體或產(chǎn)品的耐受力 。 (4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶 。 (5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力 。 (6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 。 如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性 。 提高特定基因的表達(dá)水平 ? (1)引入強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào) ， 可通過(guò)在一高效表達(dá)載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強(qiáng)啟動(dòng)子；修改現(xiàn)有表達(dá)信號(hào) ， 提高基因效力等 。 ? (2)誘導(dǎo)解除基因表達(dá)抑制的突變 。 改進(jìn)菌種的生長(zhǎng)效率 ? 提高菌株對(duì)底物的利用率方法： ? a. 通過(guò)確定并改變代謝中的耗能部分 。 ? b. 由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來(lái)實(shí)現(xiàn) 。 ? c. 賦予菌種對(duì)多種底物 ， 特別是價(jià)廉而豐富的底物的利用能力 ， 由此可降低操作費(fèi)用 。 第四節(jié) 誘變育種 ? 以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高 ， 一個(gè)基因的自然突變頻率僅 1061010左右 。 ? 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種 ， 是迄今為止國(guó)內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量 、 性能的主要手段 。 誘變 物理、化學(xué)或生物誘變方法 一、誘變劑和誘變處理 ? 物理誘變劑：射線如紫外線 、 X— 射線 、 γ—射線 ， 快中子； ? 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線 。 許多高產(chǎn)菌株的選育都用過(guò)紫外線 ，對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室 、 中小型工廠都適用 ， 也很安全 。 ? 其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的 ， 有一定的穿透力 ， 一般都由專(zhuān)業(yè)人員在專(zhuān)門(mén)的設(shè)備中使用 ，否則有一定危險(xiǎn)性 。 化學(xué)誘變劑： 化學(xué)因子如堿基類(lèi)似物 、 5— 氟尿嘧啶 、 烷化劑等 。 化學(xué)誘變劑中使用最多 、 最有效的是烷化劑 。 使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)： 大多數(shù)情況下 ， 就突變數(shù)量而言 ， 要比電離輻射更有效 。 化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的 ， 因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑 ， 設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿 ，一個(gè)蒸氣罩 。 而用電離輻射 177。 行工作時(shí) ， 設(shè)備費(fèi)用大 ， 并要注意安全性 。 大部分誘變劑是致癌劑 ， 所以在使用中必須非常謹(jǐn)慎 ， 要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸 ，且切勿吸入其蒸氣 ， 有人對(duì)某些誘變劑極其敏感 ， 甚至未直接接觸就會(huì)過(guò)敏 ， 這就更要當(dāng)心 。 誘變劑的選擇 1． 堿基類(lèi)似物和羥胺具有很高的特異性 ， 但很少使用 ， 回復(fù)突變率高 ， 效果不大 。 2． 亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣 ， 造成的遺傳損傷較多 。 其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱(chēng)為“ 超誘變劑 ” ， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一 。 3． 吖啶類(lèi)誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷 。 4． 紫外線仍十分有效 。 電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑 ， 它能造成不可回復(fù)的缺突變 。 但它可能影響鄰近基因的性能 。 二、誘變育種步驟 ?出發(fā)菌株的選擇 ?處理菌懸液的制備 ?誘變處理 ?中間培養(yǎng) ?分離和篩選 (一 )出發(fā)菌株的選擇 1． 自然界新分離的野生型菌株 ， 對(duì)誘變處理較敏感 ， 容易達(dá)到好的效果 。 2． 在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像 ， 也是良好的出發(fā)菌株 。 3． 每次誘變處理都有一定提高的菌株 ， 往往多次誘變能積累較多的提高 。 4． 出發(fā)菌株開(kāi)始時(shí)可以同時(shí)選 2～ 3株 ， 在處理比較后 ， 將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變 。 5．要盡量選擇單倍體細(xì)胞、單核或核少的多細(xì)胞體來(lái)作出發(fā)誘變細(xì)胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，就要選對(duì)數(shù)期的細(xì)胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 (二 )處理菌懸液的制備 ? 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的 、活力類(lèi)似的菌懸液 ， 為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng) ， 并要離心 ， 洗滌 ， 過(guò)濾 。 (三 )誘變處理 根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹 ， 結(jié)合誘變對(duì)象的實(shí)際 ， 設(shè)計(jì)誘變處理方案 。 (四 )中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來(lái)之前 ， 有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過(guò)程 ， 即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過(guò)程 (生理延遲 )， 需 3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來(lái) 。 這個(gè)過(guò)程對(duì)今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的 。 方法： 讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí) ， 以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制 ， 讓細(xì)胞繁殖幾代 ， 以得到純的變異細(xì)胞 。 這樣 ， 隱性的變異就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái) ， 若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng) ，直接在平皿上分離就會(huì)出現(xiàn)變異和不變異細(xì)胞同時(shí)存在于一個(gè)菌落內(nèi)的可能 ， 形成混雜菌落 ，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來(lái)的菌株退化 。 (五 )分離和篩選 ? 篩選分初篩和復(fù)篩 。 初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的 ， 以量為主 。 ? 復(fù)篩則是精選 ， 以質(zhì)為主 ， 也就是以精確度為主 。因此在具體方法上就有差異 . 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來(lái)挑取參加復(fù)篩者 ， 而將 90%的菌落淘汰 。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再?gòu)?fù)篩的菌株 ， 最后才能選得優(yōu)秀菌株 。 在以后的復(fù)篩階段 ， 還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離 ， 純化菌株 。 紫外線的誘變育種 ? 紫外線誘變一般采用 15W紫外線殺菌燈 ， 波長(zhǎng)為 2537A． 燈與處理物的距離為 15～ 30cm， 照射時(shí)間依菌種而異 ， 一般為幾秒至幾十分鐘 。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示 ， 希望照射的劑量死亡率控制在 70～ 80%為宜 。 ? 被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為 106個(gè)／ ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為 106～ 107個(gè)／ ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約 ～ ，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。 ? 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。 (二 )操作步驟 1． 將細(xì)菌培養(yǎng)液以 3000r／ min離心 5min， 傾去上清液 ， 將菌體打散加入無(wú)菌生理鹽水再離心洗滌 。 2． 將菌懸液放入一巳滅菌的 ， 裝有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)用手搖動(dòng) ， 以打散菌體 。 將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過(guò)濾 ， 單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi) ， 一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá) 108個(gè)／ ml左右 ， 作為待處理菌懸液 。 3． 取 2～ 4m1制備的菌液加到直徑 9cm培養(yǎng)皿內(nèi) ，放入一無(wú)菌磁力攪拌子 ， 然后置磁力攪拌器上 、15W紫外線下 30cm處 。 在正式照射前 ， 應(yīng)先開(kāi)紫外線 10min， 讓紫外燈預(yù)熱 ， 然后開(kāi)啟皿蓋正式在攪拌下照射 10～ 50s。 操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行 ，或用黑紙包住 ， 避免白熾光 。 4．取未照射的制備菌液和照射菌液各 行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 5．取照射菌液 2ml于液體培養(yǎng)基中 (300ml三角瓶?jī)?nèi)裝 30ml培養(yǎng)液 )， 120r／ min振蕩培養(yǎng) 4～ 6h。 6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7．挑取菌落進(jìn)行篩選。 亞硝基胍誘變曲霉菌 ? N— 甲基 — N39。 硝基 N 亞硝基胍 (NGN ，MNNG或 TG)對(duì)真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用 。 其精確的作用機(jī)制尚不很清楚 ， 據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸 ， 直接作用于細(xì)胞內(nèi)的 DNA復(fù)制系統(tǒng) ， 從而誘發(fā)了變異 。 MNNG的誘變作用隨 pH的升高而增強(qiáng) 。 ? (二 )操作步驟 1． 單孢子懸液制備 取斜面 ， 加入 6ml ／ L ， 用接種環(huán)刮下孢子 ， 振蕩試管 ， 立即通過(guò)帶濾紙漏斗過(guò)濾 ， 由此制得單孢子懸液 ， 若孢子液渾濁狀 ， 其孢子濃度可達(dá) l06個(gè)／ ml， 此為待處理孢子懸液 。 2． MNNG溶液的制備 用分析天平稱(chēng)取 2mg， 加入 2ml ／ L pH ， 于暗處振蕩溶解 。 3．誘變處理