【正文】 Nocardia petroleophila)可利用甲基環(huán)己烷生長，其最初降解步驟如下圖所示。 嗜石油諾卡氏菌對甲基環(huán)己烷降解 第六節(jié) H2 和 CO2 的微生物代謝 一、 H2的微生物代謝 1，分解代謝 氫細菌都是一些呈革蘭氏陰性的兼性化能自養(yǎng)菌。它們能利用分子氫，氧化產(chǎn)生的能量同化 CO2，也能利用其它有機物進行生長。 在有分子氫和氧的條件下，氫細菌在生長過程中實際上包括兩個過程：①分子氫氧化成水，放出能量；②分子氫還原 CO2 成為細胞物質(zhì)，總的結(jié)果是以 6： 2： l 的比例消耗 H2，O2 和 CO2，其反應如下： 四分子氫 氧化成水所放出的能量可產(chǎn)生一分子 ATP，用于還原 CO2 構(gòu)成細胞物質(zhì)和維持細菌的生長。 氫細菌的細胞膜上有泛醌、維生素 K2及細胞色素等呼吸鏈成分，但與其它的好氧微生物不同，在氫細菌里，電子直接從氫轉(zhuǎn)移到呼吸鏈，電子再經(jīng)呼吸鏈傳遞產(chǎn)生 ATP，一種不透明的諾卡氏菌 (Nocardia opaca)只含有一種可溶性氫化酶，它可使氫還原 NAD+產(chǎn)生NADH，然后， NADH 再作呼吸鏈的供氨體，產(chǎn)生 ATP。 在多數(shù)氫細菌中，有兩種氫化酶，其結(jié)構(gòu)和功能各不相同。 （ 1）顆粒狀氫化酶 (particulate hydrogenase) 如真養(yǎng)產(chǎn)堿菌 (A． eutrophus)的顆粒狀氫化酶是由兩個亞基組成的，一個亞基分子量為37000，另一個亞基分子量為 37000，二者之比為 1： 1。顆粒狀氫化酶結(jié)合在細胞質(zhì)膜上，它直接與呼吸鏈偶聯(lián)，不經(jīng)過依賴于 NAD+的脫氫酶作中間體，催化氫的氧化，并把電子直接傳給呼吸鏈產(chǎn)生 ATP。電子在呼吸鏈上傳遞可能有兩條途徑：一條是依賴于維生素 K2(VK2)的途徑；另 — 條是與維生素 K2 無關的途徑。兩條途徑中都有細胞色素存在，在許多氫細菌中還發(fā)現(xiàn)有 CoQ，一般認為 ATP 產(chǎn)生是電子從氫傳到細胞色素 b 的部位，顆粒狀 氫化酶不受過量 ATP 的抑制，但可被 NADH、 CN 利 CO 所抑制。 （ 2）可溶性氫化酶 (so1uble hydrogenase) 真養(yǎng)產(chǎn)堿菌 (A． eutrophus)的可溶性氫化酶存在于細胞質(zhì)中，由四聚體復合組成，其中三個亞基 (分子量分別為 63000、 60000、 29000，摩爾比例為 1： 1： 2，還含有黃素單核苷酸和 FeS 中心 (FMN： Fe： S 摩爾比為 2： 12： 12)。 可溶性氫化酶催化氫的氧化，能直接還原 NAD+，還能還原 Cytb、 Cytc 等，它不與氧、NAD+和甲烯藍起反應，它受 ADP 相 ATP 相對濃 度的控制，當 ADP 缺少， ATP 過量時，酶的活性受抑制。反應產(chǎn)物 NADP 對酶也有抑制作用?？扇苄詺浠覆皇?CN、 CO 的抑制。它的主要功能是為菌體生長提供固定 CO2 的還原力。另外，它可直接運送電子進入呼吸鏈，兩種氫化酶的作用及電子傳送途徑見下圖。 真養(yǎng)產(chǎn)堿菌中兩種氫化酶的功能。 偶聯(lián)部位以阿拉伯數(shù)字標明。 Phase（顆粒狀氫化酶）、 Shase（可溶性氫化酶） 在真養(yǎng)產(chǎn)堿菌中，同時含有 CoQ 和 VK2，因培養(yǎng)條件不同，這兩種物質(zhì)的相對濃度則不同。在氧限量時， CoQ 明顯減少，當氧過量時， VK2 含量極微。 必須指出，氫細菌是 — 類兼性化能自養(yǎng)菌，在有 O2無 H2時，可利用糖或有機酸或氨基酸而生長。有的還可利用嘌呤和嘧啶進行生長。 當氫細菌以無機化能營養(yǎng)方式生長時， H2 的存在能阻抑菌體對有機物 (如對果糖 )的利用，這種現(xiàn)象稱為氫效應。共原因有兩方面： (1)果糖的利用是通過 ED 途徑進行的。當有氧存在時，分子氫使 ED 途徑中酶合成的誘導受到抑制，因而不能利用 ED 途徑分解有機物，包括果糖。 (2)果糖經(jīng) ED 途徑分解的關鍵是進行脫氫氧化。在氫細菌體內(nèi) NAD(P)+是有限的，當有 O 2 和 H 2 時，氫化酶催化生成 NAD(P)H，餃菌體內(nèi) NAD(P)+減少。由于果糖分解脫下的氫不能交給 NAD(P)+(因消耗于環(huán)境中氫的還原 )故在這種情況下不能利用果糖等有機物。其實質(zhì)是氫細菌中的氫化酶與 ED 途徑的關鍵酶 —— 脫氫酶爭奪體內(nèi)有限的 NAD(P)+，而使生長停止。 氫化酶是氫細菌進行無機化能營養(yǎng)方式生長的關鍵酶，通過誘變使氫細菌中的 Hase 缺失，這種菌株在 O2 和 H2的系統(tǒng)中利用有機物而喪失了無機化能自養(yǎng)的特性，這表明 Hase缺失，使菌體中 NAD(P)+可完全用于脫氫酶的脫氫。 2，合成代謝 （ 1）直接光解技術(shù)（綠藻） 在厭氧條件下，綠藻既可以利用氫作為電子供體用于二氧化碳的固定或釋放氫氣 由于氧對氫酶的嚴重抑制，必須將光合放氧和光合放氫在時間上或空間上分開，可以通過部分抑制 PSII 光化學活性來實現(xiàn)：元素調(diào)控，如：硫、磷。 PSII 抑制劑，如： DCMU、CCCP、 FCCP。 代表性藻株有 :Chlamydomonas reinhardtii。 產(chǎn)氫速率為： mmol H2/L ,100h. （ 2）間接光解產(chǎn)氫（藍細菌） 藍細菌主要分為：藍綠藻、藍藻綱類、藍藻類 總反 應式為： 12H2O + 6CO2 Light energy C6H12O6 +6O2 C6H12O6 + 12H2O Light energy 12H2 +6CO2 代表性菌（藻）株： Anabaena variablilis（ umol H2/mg chla/h） （ 3）光發(fā)酵產(chǎn)氫（無硫紫細菌） 無硫紫細菌在缺氮條件下，用光能和還原性底物產(chǎn)生氫氣 : C6H12O6 + 12H2O Light energy 12H2 + 6CO2 代表菌株為： Rhodospirillum rubrumL（ 180 ml H2/L of culture/h）； （ L H2/L or immobilized culture/h）。已有將這類微生物光發(fā)酵產(chǎn)氫用于處理有機廢水的實例。 （ 4）光合異養(yǎng)微生物水氣轉(zhuǎn)化反應產(chǎn)生氫氣 一些光合異養(yǎng)微生物在暗條件下能夠利用 CO 做為 單一碳源，產(chǎn)生 ATP 的同時釋放出H CO2 CO(g) + H2O(l) → CO2(g) + H2(g) ① Rubrivivax gelatinosus CBS 不僅可以 在暗條件下進行 CO水 氣轉(zhuǎn)換反應，而且能利用光能固定 CO2 將 CO 同化為細胞質(zhì)；即使在有其 他有機底物的情況下，其也能夠很好利用CO ② Rubrivivax gelatinosus CBS 能夠 100%轉(zhuǎn) 換氣態(tài)的 CO 成 H2。 ③ 這類微生物的氫酶具有很強的耐氧性，在空 氣中充分攪拌時氫酶的半衰期為 21h。代表性菌株： Rubrivivax gelatinosus CBS （ 96mmol H2/mg cdw/h）。 （ 5）暗發(fā)酵制氫 厭氧細菌利用有機底物進行暗發(fā)酵產(chǎn)生氫氣；溫度范圍 2580℃ ，或超高溫 80 ℃ ① 當乙酸為終產(chǎn)物時： C6H12O6 + 2H2O→ 2CH3COOH + 4H2 + 2CO2 ② 當丁酸為終產(chǎn)物時： C6H12O6 + 2H2O→ CH3CH2CH2COOH + 2H2 + 2CO2 當 H CO2 分壓增加，產(chǎn)氫速率明顯降低，合成更多與產(chǎn)氫競爭的底物 二、 CO2 的微生物代謝 Calvin 循環(huán)的三個階段 自養(yǎng)微生物，包括光能自養(yǎng)和化能自養(yǎng)，固定 CO2的途徑有以下三條。 二磷酸核酮糖環(huán) ：這個途徑最初是由卡爾文 (Calvin)等研究綠藻的光合作用時查明的，所以又稱 為卡爾文環(huán)。二磷酸核酮糖環(huán)是所有光能自養(yǎng)和化能自養(yǎng)微生物所共有的途徑。 經(jīng)卡爾文循環(huán)固定 CO2的過程可分為三個階段： 羧化階段：也就是 CO2 的固定階段，該反應是在二磷酸核酮糖羧化酶催化下，以 l， 5— 二磷酸核酮糖作為 CO2 的受體，生成一個 6 碳的中間化合物，此化合物不穩(wěn)定，隨即水解成二分子 3— 磷酸甘油酸。 在上述反應式中，只有一個 3P甘油酸分子中的羧基來自 CO2。 3P甘油酸是 CO2固定過程中的第一個穩(wěn)定中間產(chǎn)物。 還原階段：被固定在 3P甘油酸分子中的碳原子與 CO2 中的破原子一樣，具有同樣的氧化水 平，只有經(jīng)過還原階段，才能使來自 CO2 的碳原子還原到碳水化合物的氧化水平。還原過程包括兩步反應： 反應中 ATP 和 NADPH2 是必需的，前者參與活化羧基的磷酸化反應，后者實際上是自身還原。應該指出，磷酸甘油醛脫氫酶是糖酵解 (BMP)途徑和二磷酸核酮糖環(huán)中所共有的酶。在糖酵解反應中是以 NAD 為輔酶，所催化的反應是降解與氧化；而在二磷酸核酮糖環(huán)中是以 NADPH2 為輔酶，所催化的反應是生物合成與還原。這種差異很重要，因為這樣可以使一個酶在不同條件下催化兩種性質(zhì)不同的反應，各自行使功能。這也是細胞如何將生 物合成與降解途徑分開的一個手段。 再生階段： CO2 固定所生成的 3磷酸甘油醛，一部分被用于代謝活動或合成己糖。另一部分則轉(zhuǎn)化 (異構(gòu) )為磷酸二羥丙酮，后者再與另一分子 3磷酸甘油醛縮合成 l， 6二磷酸果糖，并經(jīng)水解脫磷酸生成 6磷酸果糖。所生成的 6磷酸果糖又和另一分子 3磷酸甘油醛經(jīng)轉(zhuǎn)酮酶催化，生成 5磷酸木酮糖和 4磷酸赤蘚糖。所生成的 4磷酸赤蘚糖，在醛縮酶催化下，與另一分子磷酸二羥丙酮縮合成 l， 7二磷酸景天庚酮糖。后者經(jīng)磷酸酯酶催化，水解掉 Cl 位上的磷酸基團，而生成 7磷酸景天庚酮糖，這是一個不可 逆反應，保證卡爾文環(huán)沿合成方向進行。 由上述一系列反應所生成的 7磷酸景天庚酮糖在轉(zhuǎn)酮酶催化下與另一分子 3磷酸甘油醛反應，生成 5磷酸木酮糖和 5磷酸核糖， 5磷酸核糖經(jīng)異構(gòu)化生成 5磷酸核酮糖， 5磷酸木酮糖經(jīng)表異構(gòu)化也生成 5磷酸核酮糖。這些 5磷酸核酮糖在 5磷酸核酮糖激酶的催化下，都形成 1， 5二磷酸核酮糖，因而 CO2 受體得以再生 (圖 63)，又可接受 CO2，重復上述一系列的反應，最終結(jié)局是將 CO2 同化成為己糖，在此過程中消耗了大量的 ATP 和 NADPH2。 1， 5二磷酸核酮糖的再生，是卡爾文環(huán)的 特有反應，它的再生需要能量，是不可逆反應，需要 5磷酸核酮糖激酶催化。 Calvin 環(huán)中 CO2 受體的再生 綜上所述，卡爾文環(huán)中包括了 BMP 和 HMP 途徑中的某些反應，但是卡爾文環(huán)有自身的關鍵酶系，而且這些酶系所催化的反應都是不可逆的，它們是 1， 5二磷酸核酮糖羧化酶，1， 7二磷酸景天庚酮糖磷酸酯酶和 5— 磷酸核酮糖激酶。由于這些酶存在，保證卡爾文能沿合成方向運行。 卡爾文環(huán)每運行一周可將 6 分子 CO2 同化成 1 分子葡萄糖。為此需要 6 分子 1， 5二磷酸核酮糖分別作為 CO2 的受體，共生成 12 分子 3磷酸甘油酸 ，在此羧化階段，并不消耗能量。大量的能量消耗在由 3磷酸甘油酸被還原成 3磷酸甘油醛的還原階段，共計消耗 12 分子 ATP 和 12 分子 NADPH2，在還原階段所生成的 12 分子 3磷酸甘油醛中，有 2分子被用以縮合成 1 分子葡萄糖，其余 10 分子 3磷酸甘油醛與參與 CO2受體分子再生的復雜反應系列，最終又組建成 6 分子的 1， 5二磷酸核酮糖，在這個復雜的反應系列中，除最后一步反應，由 5磷酸核酮糖生成 1， 5二磷酸核酮糖，需要 ATP 外 (共需要 6 分子 ATP)，其它反應都不需要外加能量。因此，每合成一分子葡萄糖，需要固定 6 分子 CO2，消耗 l8 分子 ATP和 12 分子 NADPH2，總反應式為： 6CO2+18ATP+12NAD(P)H2 C6H12O6+18ADP+18Pi+12NAD（ P） ATP 和 NAD(P)H2被稱為同化力，在光合生物中是靠光能形成的，在無機自養(yǎng)細菌中則靠氧化無機物獲得。 卡爾文環(huán)的能量轉(zhuǎn)化效率相當高， 18molATP 約計 ， 12molNADPH2 約計，即每合成 lmol 葡萄糖需輸入 。而 1mol 葡萄糖被徹底氧化時會放出約。因此，有 90％的能量被貯存在合成產(chǎn)物葡萄糖分子中，只有 10％的輸入能量消耗于卡爾文環(huán)的運行，因此，能量轉(zhuǎn)化效率是很高的。 另外還有還原的三羧酸環(huán)和還原的單羧酸環(huán)兩條途徑，感興趣的同學可參閱相關參考書?？傊?，自養(yǎng)型 CO2 固定的特點是 CO2被固定在一有機物受體上，一些接受了 CO2的受體分子經(jīng)過一系列的反應，將 CO2 組成碳水化合物，并重新生成該受體。 （二）異養(yǎng)型 CO2固定 異養(yǎng)型 CO2的固定主要是合成 TCA 環(huán)的中間產(chǎn)物。從理論上來講，利用 1 分子草酰乙酸就可以不斷地推動 TCA 環(huán)的運行 (因為草酰乙酸可通 過 TCA 環(huán)再生 )。假如 TCA 環(huán)中的中間產(chǎn)物被用作生物合成的原材料，那么就必須加以補充，才能維持 TCA 的正常運行。異養(yǎng)微生物依靠固定 CO2 生成四碳二羧酸，補充 TCA 環(huán)的中間產(chǎn)物。催化這類反應的酶有以下幾種： 1，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶：它催化磺酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸并產(chǎn)生無機磷酸． 2，磷酸烯醇式丙酮酸羧基激酶：它催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，同時使 ADP