【正文】 弱毒株的培育。許多疫苗的溫度敏感株（ ts）都經(jīng)過誘變選擇的。如 NDVLa Sota株和B1株，雞馬立克氏病血清 II型（ SB Z4）毒株，已成功地用于制作活疫苗。 、毒種的選育 ? 3） 人工傳代致弱毒株 在培組織或細(xì)胞培養(yǎng)中、雞胚內(nèi)或非宿主體內(nèi)等連續(xù)傳代減弱病原的致病性，以制作活疫苗，如豬瘟活疫苗。 1）基因缺失疫苗株 2）重組載體疫苗株。靶動物接種菌（毒）種后，與未接種的動物同時觀察免疫器官或組織的變化，或同時再免疫接種其它疫苗，觀察兩組的疫苗抗體產(chǎn)生情況和 /或抗強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)情況。 3） 外源病毒檢驗(yàn) ? 禽源種毒 ? 1) 雞胚接種檢查法 將種毒中和后分別經(jīng)尿囊腔和絨毛尿囊膜途徑接種 9－ 11日齡的 SPF雞胚 10枚，雞胚應(yīng)發(fā)育正常，絨毛尿囊膜無病變，雞胚尿囊液對雞紅細(xì)胞凝集陰性。觀察期間不應(yīng)由種毒引起的特異性局部或全身和呼吸道癥狀或死亡。此外禽白血病病毒的檢驗(yàn)（ COFEL或 ELISA）和 REV（ IFA）應(yīng)為陰性。經(jīng)熒光抗體染色后，不應(yīng)出現(xiàn)特異的熒光。 ? 3) 致細(xì)胞病變和紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)檢查法 經(jīng)接種傳代培養(yǎng) 7日的細(xì)胞，用適宜染色液對細(xì)胞單層進(jìn)行染色，檢查后不應(yīng)出現(xiàn)包涵體、巨細(xì)胞或其它由外源病原引起的 CPE。 制苗用主要原材料 ? 1） SPF雞或雞胚 所有禽用病毒性活疫苗及其種毒制備所用的雞胚必須符合 《 獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 》 中有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，即必須來源于 SPF雞。必須經(jīng) 17種病原（ 13種病毒， 2種細(xì)菌， 2種支原體的檢測，結(jié)果陰性方可使用。 《 農(nóng)業(yè)部關(guān)于加強(qiáng)獸用生物制品生產(chǎn) 檢驗(yàn)原料監(jiān)督管理的通知 》 ( 農(nóng)醫(yī)發(fā) [2022]l0號令 ) ◆ 2022年 1月 1日起，農(nóng)業(yè)部將對 GMP疫苗生產(chǎn)企業(yè)疫苗菌 (毒 )種制備與鑒定、活疫苗生產(chǎn)以及疫苗檢驗(yàn)使用無特定病原體 (SPF級 )雞、雞胚情況進(jìn)行全面監(jiān)督檢查。 3）其它原材料 ? 血清、化學(xué)試劑和生物制劑 細(xì)胞培養(yǎng)用血清能提供人工合成培養(yǎng)液必須的物質(zhì)，對細(xì)胞附著和保護(hù)有明顯的作用，各種動物的血清都能應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)室常用新生犢牛血清，既可大量采集，又有良好的細(xì)胞培養(yǎng)效果。用成年動物血清培養(yǎng)細(xì)胞，效果大都不如犢牛血清，常含有抗病毒抗體或其它抑制病毒的物質(zhì)，抑制病毒的生長。固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時，將檢驗(yàn)合格的二級種子接種于瓊脂培養(yǎng)基上布勻，置適宜的溫度下培養(yǎng)一定時間，經(jīng)檢查合格后加入穩(wěn)定劑將菌苔洗下，過濾， 2— 8?C靜置沉淀。 疫苗配制與凍干 ? 1）液體（濕）苗的配制 疫苗原液或半成品檢驗(yàn)合格后，將菌（毒）液混合，按規(guī)定頭份定量分裝，每頭份疫苗不得低于規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn)。凍干后在真空狀態(tài)下在凍干柜內(nèi)自動壓塞，出箱后壓上鋁帽。常用的有： 5%蔗糖（乳糖）脫脂乳、明膠蔗糖、 40%蔗糖明膠、聚乙烯吡咯烷酮乳糖和 SPGA。 不同微生物保護(hù)劑的主要成分 微生物類型 凍干保護(hù)劑主要成分 細(xì)菌 10%蔗糖、 5%蔗糖脫脂乳、 5%蔗糖、 %明膠； 10— 20%脫脂乳、含 1%谷氨酸鈉的 10%脫脂乳； 5%牛血清白蛋白的蔗糖；滅活馬血清等 厭氧菌 含 %谷氨酸鈉的 10%脫脂乳， 10 %脫脂乳， %葡萄糖血清等 病毒 常用下列物質(zhì)的不同濃度或按不同比例混合組成凍干保護(hù)劑： 明膠、血清、谷氨酸鈉、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、水解乳蛋白、乳酸鈣、海藻糖、硫脲等 支原體 50%馬血清、 1%牛血清白蛋白、 5%脫脂乳、 %葡萄糖馬血清等 立克次體 10%脫脂乳 酵母菌 馬血清或含 %葡萄糖馬血清、含 1%谷氨酸鈉的 10%脫脂乳等 （三）疫苗質(zhì)量改進(jìn)新技術(shù) 疫苗質(zhì)量中問題 弱毒活疫苗：凍干保護(hù)劑；毒力偏強(qiáng)；外源病原污染。 改進(jìn)新技術(shù) ? 1）分子設(shè)計(jì)與基因工程技術(shù) 亞單位疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、 DNA疫苗轉(zhuǎn)基因植物疫苗等。 ? 3）新型免疫佐劑 減少副反應(yīng)，提高細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用。 ? 5）現(xiàn)代細(xì)胞工程技術(shù) 利用細(xì)胞反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。 （一）診斷抗原的制備 ? 診斷抗原類型 按性質(zhì)可將診斷抗原分顆粒性抗原和可溶性抗原。 診斷抗原類型 ? 1）凝集反應(yīng)抗原 此類抗原多為顆粒性抗原，在有電解質(zhì)的情況下，與特異性抗體結(jié)合形成肉眼可見的凝集塊，稱凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)有直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。間接凝集反應(yīng)是將病原微生物的可溶性抗原物質(zhì)吸附在顆粒性載體如紅細(xì)胞、膠乳顆粒、炭素顆粒等的表面，制備成可產(chǎn)生凝集反應(yīng)的顆粒性抗原成分。相反將免疫球蛋白連接到紅細(xì)胞的表面，即為反相間接血凝試驗(yàn)。檢驗(yàn)系統(tǒng)包括已知的抗原（或抗體）、被檢的抗體（或抗原）和補(bǔ)體。補(bǔ)體是兩個系統(tǒng)共用的。反之若抗原與抗體不相應(yīng)，則不能結(jié)合補(bǔ)體，補(bǔ)體即參與溶血系統(tǒng)反應(yīng)，導(dǎo)致溶血現(xiàn)象。 ? 3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗原 將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果，包括直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法等。 既有固定血清 —稀釋病毒方法（ ?法），又有固定病毒 — 稀釋血清（ ?法）。 6）變態(tài)反應(yīng)抗原 ? 某些細(xì)胞內(nèi)寄生菌、病毒、真菌、寄生蟲等，感染后可引起以細(xì)胞免疫為主的 IV型變態(tài)反應(yīng)。如鼻疽菌素、結(jié)核菌素、布氏菌水解素、提純副結(jié)核菌素等。 ? 不同的微生物制備診斷抗原的方法不同，不同的抗原制備方法也有差異。中和試驗(yàn)抗原制備比較簡單，一般不需提純與濃縮。 ? 免疫動物的選擇 制備免疫血清的動物多為家兔、豚鼠、馬、牛、羊及雞等。禽類血清有抗補(bǔ)體成分，在制備補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)用抗血清時應(yīng)選用哺乳動物。免疫抗原的提純和濃縮，是制出高效價血清的先決條件。 ? 有一些用球蛋白抗原制備抗抗體血清時，須要加適當(dāng)佐劑注射，如用弗氏完全或不完全佐劑，背部皮下多點(diǎn)注射，第一次免疫加完全佐劑，以后多次免疫只能使用不完全佐劑，隔 7— 10天加強(qiáng)免疫一次，可以獲得較好的抗抗體血清。采血量可按動物體重每公斤采 10ml左右。 3～ 4天后進(jìn)行第二次采血。 免疫血清的檢驗(yàn)與標(biāo)化 ? 1）免疫血清的檢驗(yàn)：診斷用血清的檢驗(yàn)主要是特異性、敏感性和效價的測定。 ? 2 ）免疫血清的標(biāo)化：診斷用陽性血清，特別是分群血清和分型血清等，均須標(biāo)化成為標(biāo)準(zhǔn)品或參考標(biāo)準(zhǔn)品，有些還須用國際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)化，定出國際單位 (1U)。 ? 豬瘟熒光抗體的制備方法 將高免血清用飽和硫酸銨鹽析法提取免疫球蛋白 G（ IgG），用 2％（ W/V）抗體蛋白液按80： 1的重量比與異硫氰酸熒光素（ FITC）在 10?C左右結(jié)合 6小時。 四、獸用生物制品檢測技術(shù) （一）獸用生物制品檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 獸用活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)： 物理性狀：液體疫苗應(yīng)無異物、搖不散的凝塊、絮狀物、霉團(tuán)、變質(zhì)；凍干疫苗無干縮、瓶破裂、瓶口密封不嚴(yán)。病毒組織苗如有細(xì)菌污染，非病原菌每頭份不超過 1個；病毒性活疫苗不應(yīng)污染支原體和外源病毒，尤其是明確規(guī)定禽源活疫苗必須用 COFAL試驗(yàn)檢測不應(yīng)有禽白血病病毒的污染。 獸用活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 安全檢驗(yàn)： 在專用動物舍進(jìn)行，一般使用 10個頭份的疫苗進(jìn)行 ,無論是本動物或非本動物進(jìn)行的安全檢驗(yàn)，必須全部符合規(guī)定。 效力檢驗(yàn)： 1）病毒滴定或細(xì)菌計(jì)數(shù)：應(yīng)保證比最小免疫原性的數(shù)量大，且在規(guī)定的有效期內(nèi)均不應(yīng)低于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。 水份測定：不應(yīng)超過 4%。 獸用滅活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 物理性狀：油乳劑滅活疫苗的外觀應(yīng)為乳白色均勻乳劑，單相苗 為油包水，雙相苗為水包油包水劑型； 37℃ 放置 21天 不破乳；單相苗的粘度在 10秒以內(nèi)，雙相苗的粘度在 5秒以內(nèi)。 安全檢驗(yàn)： 在專用動物舍進(jìn)行，一般使用 2個頭份的疫苗進(jìn)行 檢驗(yàn)， 無論是本動物或非本動物進(jìn)行的安全檢驗(yàn)， 必須全部符合規(guī)定。 甲醛、苯酚、硫柳汞含量測定：甲醛含量不應(yīng)超過 %；苯酚含量不應(yīng)超過 %；硫柳汞含量不應(yīng)超過 %。 ?化學(xué)分析方法：滅活疫苗中甲醛、硫柳汞和苯酚含量測定采用的是化學(xué)分析滴定方法。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ? 血凝與血凝抑制試驗(yàn)：血凝試驗(yàn)是利用具有血凝性病毒選擇性的 凝集動物紅細(xì)胞的特性來測定病毒的效價。血凝抑制 試驗(yàn)利用病毒凝集紅細(xì)胞的特性能被相應(yīng)抗體抑制來測定相應(yīng)抗體的效 價，常用在具有血凝性病毒疫苗如產(chǎn)蛋下降綜合征、豬和犬細(xì)小病毒病 等滅活疫苗及 ND疫苗免疫動物后血清抗體的檢測（效力檢驗(yàn)）。 前者用于仔豬大腸菌 K8 K99雙 價基因工程滅活疫苗、豬囊蟲病滅活疫苗的效力檢驗(yàn)或間接血凝診斷試 劑的檢驗(yàn)。以膠乳 為載體的膠乳凝集試驗(yàn)用于豬偽狂犬病診斷試劑盒的檢驗(yàn)。既有固定血清 — 稀釋病毒（ ?法），又有固定病毒 — 稀釋血清（ ?法）。用血清 — 病毒混合物接種靶動物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，觀察其是否感染來判斷疫苗的效力、疫苗病毒的特異性或是否污染外源病原。 ? 雞胚中和試驗(yàn)：主要用于禽用病毒性活疫苗的特異性檢驗(yàn)和病毒性活疫苗的外源病毒檢測及疫苗的效力檢驗(yàn)。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) ：在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)反應(yīng)系統(tǒng)中 ， 當(dāng)抗原與抗體發(fā)生特 異反應(yīng)時 ， 抗原 — 抗體復(fù)合物結(jié)合一定量的補(bǔ)體 ，而指示系統(tǒng) (致敏紅細(xì)胞 ） 的溶血作用也需要補(bǔ)體的參與 。 在獸用生物制品的檢驗(yàn)中 ， 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)主要用于細(xì)菌性疾病如布魯氏菌病 、 副結(jié)核 、 衣原體病 、 鉤端螺旋體病 、 伊氏錐蟲病 、 鼻疽等補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原的檢測及馬傳貧活疫苗的抗原性檢驗(yàn) 、 禽用活疫苗及其種毒中禽白血病病毒污染的檢測 。 ?酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ ELISA） ： 已知抗原或抗體與相應(yīng)的診斷抗體或抗原在酶聯(lián)板中或玻片上發(fā)生特異性結(jié)合 ， 在酶標(biāo)記抗體和酶底物的參與下 ， 呈現(xiàn)顏色反應(yīng) 。 用于馬傳染性貧血 、 藍(lán)舌病 、 大腸桿菌病 、 豬旋毛蟲病 、 牛副結(jié)核 、 豬瘟等疫病的酶聯(lián)診斷試劑的特異性檢驗(yàn)和 （ 或 ） 效價測定 、馬傳貧活疫苗的效價測定 。 ?熒光抗體染色技術(shù) ：將抗體標(biāo)記上熒光素 ， 利用抗原抗體反應(yīng)的特異性 ， 在熒光顯微鏡下觀察熒光來檢查未知抗原 。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：用于口蹄疫病毒感染相關(guān)抗原 、馬傳貧 、 牛白血病 、 藍(lán)舌病瓊脂擴(kuò)散抗原及陽性血清的特異性檢驗(yàn)和效價測定 。 分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ? 單克隆抗體技術(shù) 在診斷制品的檢驗(yàn)中廣泛使用 。 日本血吸蟲病 、 馬傳貧 、豬瘟等診斷制品均采用單克隆抗體技術(shù)進(jìn)行制品的特異性檢驗(yàn) 。 其它如種毒的鑒定 、 病毒性活疫苗中外源病毒污染的檢測 。 謝謝！