【正文】 礎(chǔ)種子為企業(yè)生產(chǎn)獸用生物制品提供種子來源，應(yīng)作系統(tǒng)鑒定，并規(guī)定代次。 二、獸用疫苗制備技術(shù) ? （一）獸用滅活疫苗的制備技術(shù) 滅活疫苗是用菌（毒）種培養(yǎng)物或含毒組織或細(xì)胞培養(yǎng)物，經(jīng)化學(xué)滅活劑滅活或加熱處理，使微生物失去活性而保持免疫原性，再加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎┗蚣尤朊庖咦魟┲瞥伞? ? 微生態(tài)制劑：含活菌的制劑，具有調(diào)節(jié)機(jī)體菌群、增強(qiáng)免疫力、促生長等。 ? 熒光定量 PCR（ RT－ PCR）。 ? （ 8）免疫組化診斷試劑。 ? （ 4）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原：抗原抗體復(fù)合物可以激活補(bǔ)體，出現(xiàn)各種生物學(xué)反應(yīng)。 （二）診斷用制品 ? 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) （ 1）凝集試驗(yàn)抗原： 直接凝集試驗(yàn)（平板法、試管法）：抗原和抗體混合后直接發(fā)生凝集反應(yīng)。 重組活載體疫苗 ? 病原保護(hù)性抗原基因序列 → 插入另一種無毒或弱毒的微生物基因組 → 表達(dá)→ 構(gòu)建重組活載體疫苗株。 合成肽疫苗 ? 用化學(xué)方法人工合成多肽作為抗原。 活疫苗對原宿主動(dòng)物無致病性或引起亞臨床感染，能產(chǎn)生主動(dòng)免疫力，用量少、成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長。 活疫苗 (弱毒疫苗 ) 1）致弱的弱毒（菌、蟲）株 動(dòng)物、組織、細(xì)胞、雞胚或培養(yǎng)基 → 培養(yǎng) → 降低毒力、保留免疫原性 → 篩選。 滅活疫苗 (死疫苗 ) 1)強(qiáng)毒 (菌 )或弱毒（菌） → 培養(yǎng) → 滅活或加熱 → 純化或濃縮 → 佐劑或防腐劑。 按照性質(zhì)和制造方法 疫（菌）苗、類毒素、抗血清、診斷制劑和微生態(tài)制劑等。 按照作用與用途 預(yù)防、診斷和治療用生物制品。 2)滅活的毒素或提取的亞單位或 rDNA產(chǎn)生亞單位。 2）自然弱（無）毒（菌、蟲）株。但可能存在不安全風(fēng)險(xiǎn)。純度高、穩(wěn)定，但只能線性表達(dá)，不能折疊，免疫原性較差。可以同時(shí)表達(dá)多種抗原，制成多價(jià)或多聯(lián)疫苗，毒力不返強(qiáng)。 間接凝集試驗(yàn)（ 間接血凝、膠乳凝集和反相間接血凝試驗(yàn) ）。 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) ? （ 5）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）：包括直接法、間接法、雙抗體夾心、競爭 ELISA等。 生物技術(shù)和分子生物學(xué)診斷技術(shù) ? （ 1）生物技術(shù)：單克隆抗體技術(shù)（熒光抗體染色技術(shù)或酶聯(lián)免疫染色技術(shù)）。 ? 基于核酸序列擴(kuò)增技術(shù)（ NASBA）。 ? 卵黃抗體：用抗原多次免疫禽類，提取卵黃抗體制成，用于治療或預(yù)防動(dòng)物疾病。 菌（毒）種 ? 、 菌（毒）種 標(biāo)準(zhǔn) ? 歷史清楚； ? 生物學(xué)性狀明顯； ? 遺傳穩(wěn)定； ? 優(yōu)良的免疫原性與反應(yīng)原性； ? 毒力在規(guī)定的范圍內(nèi)。 ? 生產(chǎn)種子 生產(chǎn)種子由生產(chǎn)企業(yè)用基礎(chǔ)種子進(jìn)行復(fù)壯、繁殖。 ? 毒種的選育 弱毒毒種有天然弱毒株或人工致弱毒株；強(qiáng)毒毒株分離 → 系統(tǒng)鑒定（無污染、毒力強(qiáng)而穩(wěn)定、免疫原性好、抗原譜廣、與流行毒血清型相符） → 疫苗候選株。 ? 動(dòng)物繼代保存 蟲種一般通過動(dòng)物繼代保存。 ? 索?。喉毘钟邢鄳?yīng)級(jí)別機(jī)構(gòu)出具的正式公函，說明菌種名稱、型別、數(shù)量及用途。烈性傳染病或人畜共患傳染病的強(qiáng)毒菌（毒）種，必須有專職技術(shù)人員領(lǐng)取。 ? 抑菌分離培養(yǎng) 利用某些化學(xué)藥品對某類細(xì)菌的抑制或殺滅作用，而對另一些細(xì)菌不生產(chǎn)明顯的作用，來分離培養(yǎng)某些細(xì)菌。 厭氧菌的培養(yǎng) ? 化學(xué)方法 利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，吸收環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的養(yǎng)氣或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化還原電勢。 ? 在沒有條件的實(shí)驗(yàn)室，簡便的做法是用有蓋玻璃容器，放入接種的培養(yǎng)物后，點(diǎn)燃蠟燭，加蓋密閉容器，由于燃燒耗氧產(chǎn)生二氧化碳，蠟燭即熄滅。 、病毒培養(yǎng)基本技術(shù) ? 病毒細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求 ? 1）無機(jī)離子 維持滲透壓、提供細(xì)胞酶與代謝活動(dòng)所需要的物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞貼壁等。 ? 3) 氨基酸 細(xì)胞培養(yǎng)所用的氨基酸為左旋異構(gòu)體。在不含血清的培養(yǎng)液中，常含有脂溶性維生素。 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)類型 （ 1）原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是用動(dòng)物新鮮組織如胚胎或幼畜的組織或受精卵，經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制備而成。二倍體細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)可能發(fā)生變化，但細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣。適宜于許多動(dòng)物病毒的生長，易于培養(yǎng)，可以建立種子庫，質(zhì)量易控制。 ? 3) 細(xì)胞運(yùn)輸 單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶裝滿生長液，以防液體振蕩沖脫細(xì)胞，或只留少量生長液能覆蓋單層，以防細(xì)胞干燥。 細(xì)胞培養(yǎng)方法 ? 3）懸浮培養(yǎng) 在懸浮培養(yǎng)罐中通過不斷攪拌，并隨時(shí)補(bǔ)充營養(yǎng)液和校正 pH值，使細(xì)胞在懸浮的條件下培養(yǎng)生長。 雞胚接種技術(shù) ? 雞胚的選擇 必須是來源于健康易感的種雞群，其種蛋必須新鮮，清潔。沿受精卵長徑平行方向刺入針頭約 1cm，注入接種物 －，用石蠟封孔，繼續(xù)孵化。也可在氣室外和卵長徑的 1/2處各打一小孔，并在中間孔處刺入針頭約 ，接種 － ，用石蠟封孔。用長約 4號(hào)針頭插入血管內(nèi)注射接種物 。分別收獲收獲胚體、卵黃囊、尿囊液、絨毛尿囊膜等。綿羊腦內(nèi)接種時(shí)，先固定在接種臺(tái)上，剪去頭頂部的毛，并用硫化鋇脫毛，碘酊消毒后，在顱頂部中線左或右側(cè)，用錐鉆一小孔，硬腦膜下或腦內(nèi)接種 1ml，立即用火棉膠封閉接種孔。牛、羊舌面皮內(nèi)注射時(shí)，先固定動(dòng)物，抓住動(dòng)物舌頭并固定，然后接種。雞翅下肱靜脈注射時(shí)，側(cè)臥固定，張開翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用針頭斜面朝上刺入靜脈注射 1－5ml接種物。根據(jù)觀察結(jié)果，選出接種后符合要求的反應(yīng)特征的動(dòng)物，按照規(guī)定方法剖殺動(dòng)物，收集含毒血液或采集含毒組織、器官等。培養(yǎng)基與佐劑（氫氧化鋁膠、油佐劑等）均可在缸內(nèi)消毒，在缸內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)及滅活、加佐劑配苗與分裝等，可大量生產(chǎn)出質(zhì)量較好的菌苗。深層懸浮培養(yǎng)法能控制一致的細(xì)胞培養(yǎng)條件，可大規(guī)模生產(chǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)物可通過高速離心棄去培養(yǎng)液，使病毒更加純凈，可減少異性蛋白質(zhì)的含量。細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器可連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，隨時(shí)采樣觀察，生產(chǎn)效率提高 200％～ 300％，大大降低產(chǎn)品的成本；有完善的由計(jì)算機(jī)控制的檢測及培養(yǎng)系統(tǒng)，保證了運(yùn)行的安全；體積小，減少了生產(chǎn)車間所需的凈化空間面積；自動(dòng)化程度高，大大降低了污染率。 ? （ 2） 烷化劑類 為一類含有烷基分子去一個(gè)氫原子的化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入形成烷基取代物，其滅活作用主要是烷化病毒 DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鏈交聯(lián)，防礙 RNA的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂，使病毒完全喪失感染力，但不損傷保護(hù)性抗原，廣泛用于病毒的滅活。吸入空氣中的水分子時(shí)緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解，密封保存在玻璃瓶中于 4－ 8?C保存較穩(wěn)定。本品有毒、腐蝕性及特殊氣味，其滅活機(jī)制是使微生物蛋白質(zhì)變性和抑制特異酶系統(tǒng)，使其失去活性或感染性。 、滅活方法 ? 1）物理滅活方法 有熱滅活、射線照射滅活和超聲波裂解等方法。 ? 2）化學(xué)滅活方法 早在 20世紀(jì)初，就開始用甲醛減毒制備破傷風(fēng)類毒素，之后有用甲醛或苯酚滅活制成犬瘟熱疫苗。 、佐劑作用 ? 對機(jī)體的作用 引起巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞等細(xì)胞浸潤，促進(jìn)其繁殖，增強(qiáng)其活性；加速淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化成效應(yīng)細(xì)胞；增加細(xì)胞膜的活性和胞漿變化，分泌輔助性因子；改變細(xì)胞功能，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為數(shù)量增多、膜表面積增大、產(chǎn)生大量輔助因子和前列腺素等調(diào)節(jié)因子， T細(xì)胞和 B細(xì)胞表現(xiàn)為數(shù)目增多、進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，膜表面成分發(fā)生改變，產(chǎn)生大量輔助因子（ LK）， B細(xì)胞則分化為漿細(xì)胞，分泌大量的抗體。鋁膠的質(zhì)量對產(chǎn)品的質(zhì)量有直接影響，因此 《 規(guī)程 》 中明確規(guī)定了氫氧化鋁膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 ? 《 規(guī)程 》 中明確規(guī)定了注射白油（輕質(zhì)礦物油）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，要求其性狀（相對密度、粘度）、酸度、重金屬、鉛、砷、稠環(huán)芳烴、固形石蠟及易碳化物等項(xiàng)檢驗(yàn)均應(yīng)符合規(guī)定。蜂膠作為疫苗佐劑需進(jìn)行純化，蜂膠佐劑具有良好的免疫增強(qiáng)作用，能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，提高機(jī)體的特異性和非特異性免疫力。 、佐劑的類型 ? 5）微生物及其代謝產(chǎn)物佐劑 為細(xì)菌的菌體成分，具有明顯的佐劑作用。 ISCOM現(xiàn)已廣泛用于多種細(xì)菌、病毒和寄生蟲病的疫苗。 制苗工藝 1）用鋁膠作佐劑 配苗時(shí)，將滅活的菌液和氫氧化鋁膠以一定的比例（ 3： 1— 9： 1）混合，再加入適量的硫柳汞和苯酚充分振蕩而成。 ? 3）蜂膠作佐劑 配苗時(shí)，在滅活的抗原液（病毒液或菌液）中加入蜂膠乙醇浸液，使每 ml抗原液中含蜂膠 10mg，變加變振蕩，成為乳濁狀，即為蜂膠佐劑疫苗。 菌（毒）種的選育 ? 、 菌種的選育 ? 1） 自然弱毒菌株 自然界中存在著具有免疫原性的自然弱毒株，可以用于生產(chǎn)活疫苗。 、 菌種的選育 ? 3） 改變培養(yǎng)環(huán)境致弱菌株 在體外培養(yǎng)傳代病原菌時(shí)，某些突變株在正常環(huán)境中不易生長發(fā)育而死亡，但改變培養(yǎng)溫度（提高或降低），或在培養(yǎng)基中加入有抑制病原的化學(xué)物質(zhì)，有利于某些突變株的發(fā)育，如在培養(yǎng)基中加醋酸鉈分離培育出了抗醋酸鉈的豬副傷寒沙門氏菌和馬流產(chǎn)沙門氏菌弱毒菌株。 、毒種的選育 1） 自然弱毒株 選用自然界中具有免疫原性的天然弱毒株，可以用于生產(chǎn)動(dòng)物用活疫苗。 ? 4） 基因工程疫苗株的構(gòu)建 利用基因工程技術(shù)改造微生物，構(gòu)建基因工程弱毒活疫苗株。 、菌（毒）種的鑒定 ? 2） 毒力返強(qiáng)試驗(yàn) 用基礎(chǔ)菌（毒）種較早代次，按實(shí)際接種途徑大劑量接種各種最易感日齡的靶動(dòng)物，一定時(shí)間后，采集含菌（毒）靶組織制成懸液，再接種另一組易感的靶動(dòng)物，如此至少傳 5代次，觀察每次傳代動(dòng)物的反應(yīng)情況，并比較第一代和最后一代動(dòng)物的反應(yīng)和毒力或致病性增強(qiáng)的趨勢情況。 ? 3) 細(xì)胞接種檢查法 將種毒中和后接種 CEF后，培養(yǎng) 5－ 7日，不應(yīng)有特異的細(xì)胞病變（ CPE）產(chǎn)生，并不應(yīng)出現(xiàn)吸附紅細(xì)胞現(xiàn)象。 ? 2) 綠猴腎 (vero)傳代細(xì)胞檢查法 將中和后的接種 vero細(xì)胞，連傳 2代，不應(yīng)出現(xiàn) CPE，同時(shí)進(jìn)行紅細(xì)胞（豚鼠、雞和人紅細(xì)胞混合物）吸附試驗(yàn)和熒光抗體試驗(yàn)，均應(yīng)為陰性。生產(chǎn)禽用疫苗用 SPF雞應(yīng)在隔離環(huán)境中飼養(yǎng)，使用全價(jià)營養(yǎng)的無菌飼料。對達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)要求的，將根據(jù)《 獸藥管理?xiàng)l例 》 規(guī)定進(jìn)行處理。 疫苗原液的繁殖 ? 1）制苗用菌液的制備 液體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基量的一定比例接入二級(jí)種子菌液，在 37?C左右搖動(dòng)培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，當(dāng)菌液混濁或 pH下降時(shí)，停止培養(yǎng)，冷卻后收獲菌液或離心后收獲菌泥，適當(dāng)稀釋后置 2— 8?C保存?zhèn)溆谩? ? 2）凍干苗的配制 按疫苗原液量加入一定比例的保護(hù)（穩(wěn)定