【文章內(nèi)容簡介】 一次性使用。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法 ? （ 2） 培養(yǎng)罐培養(yǎng) 培養(yǎng)罐罐體結(jié)構(gòu)均為不銹鋼質(zhì)，可以自動調(diào)溫、調(diào) pH值，用無級馬達、磁攪拌、消泡、控制氧壓、自動補液、換液、自動高壓滅菌、自動計算呼吸商等。深層懸浮培養(yǎng)法能控制一致的細胞培養(yǎng)條件，可大規(guī)模生產(chǎn)，細胞培養(yǎng)物可通過高速離心棄去培養(yǎng)液，使病毒更加純凈，可減少異性蛋白質(zhì)的含量。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法 ? （ 3）微載體細胞培養(yǎng)系統(tǒng) 微載體的直徑在60～ 250 μm ，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。此法兼有懸浮培養(yǎng)法和單層培養(yǎng)法的優(yōu)點，容易大量培養(yǎng)細胞，特別是適合那些不能被懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)的二倍體細胞和原代細胞。 工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)病毒的方法 ? （ 4） 生物反應器 反應器控制系統(tǒng)由高性能、智能化的微機控制儀及附屬功能電路和器件所組成，實現(xiàn)了空氣、氧氣、氮氣和 C02氣體與 pH值、溶氧的關(guān)聯(lián)控制，能準確控制溫度、轉(zhuǎn)速、 pH值、溶解氧濃度和液位。細胞培養(yǎng)用生物反應器可連續(xù)進行培養(yǎng)，隨時采樣觀察，生產(chǎn)效率提高 200％～ 300％，大大降低產(chǎn)品的成本；有完善的由計算機控制的檢測及培養(yǎng)系統(tǒng)，保證了運行的安全；體積小，減少了生產(chǎn)車間所需的凈化空間面積；自動化程度高，大大降低了污染率。 滅活工藝 ? 、 滅活劑 ? （ 1） 甲醛溶液 （福爾馬林） 常用的甲醛溶液約含 37%甲醛氣體（重量計），為強還原劑，能與微生物蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)合，形成具有其它性質(zhì)的化合物，而擾亂微生物的代謝，適當濃度可使微生物喪失增殖力或毒力，保持其抗原性和免疫原性。用于滅活細菌的濃度為%— %，用于滅活病毒時濃度為 %— %。必要時在甲醛滅活后加入焦亞硫酸鈉以終止反應。 ? （ 2） 烷化劑類 為一類含有烷基分子去一個氫原子的化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入形成烷基取代物，其滅活作用主要是烷化病毒 DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鏈交聯(lián)，防礙 RNA的合成，從而抑制細胞的有絲分裂，使病毒完全喪失感染力，但不損傷保護性抗原，廣泛用于病毒的滅活。常用的為BEI和 AEI。 、 滅活劑 ? （ 3） ?－丙烯內(nèi)脂（ BPL） 本品為無色有刺激氣味的液體，對皮膚、粘膜有強刺激性，并具有致癌性。水中溶解度 37％（ V/V），能與丙酮、醚和氯仿混合。吸入空氣中的水分子時緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解，密封保存在玻璃瓶中于 4－ 8?C保存較穩(wěn)定。 ? （ 4）硫柳汞鈉鹽 又稱乙基汞硫代水楊酸鈉，本品為劇毒品，能溶于水和醇，在空氣中穩(wěn)定，在日光下不穩(wěn)定。對細菌、霉菌和病毒有一定的滅活作用，用于滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，常用終濃度為 %－ %。 、 滅活劑 ? （ 5）苯酚 又名石炭酸，為羥基與芳烴族（苯環(huán)與稠丙環(huán)）直接連接的化合物，其中苯的一部分被酚取代。本品有毒、腐蝕性及特殊氣味，其滅活機制是使微生物蛋白質(zhì)變性和抑制特異酶系統(tǒng)，使其失去活性或感染性。常作為細菌滅活疫苗的抑菌劑、消毒劑或滅活劑，用量為 －%。 ? （ 6）結(jié)晶紫 別名甲基青蓮或甲紫，為一種堿性染料，易溶于醇，能溶于氯仿，不溶于水或醚。其陽離子與微生物蛋白質(zhì)帶陰電的羥基形成弱電力的化合物，防礙微生物的正常代謝，也可擾亂微生物的氧化還原作用，使電勢太高，不利于微生物的增殖。 、滅活方法 ? 1）物理滅活方法 有熱滅活、射線照射滅活和超聲波裂解等方法。采用熱滅活方法牛副結(jié)核滅活疫苗和草魚出血病滅活疫苗。超聲波裂解應放冰浴中間斷進行，以免升溫過高影響微生物的抗原性。 60Co照射處理，應根據(jù)被照射物的容量大小選擇照射物與鈷源的距離和劑量。 ? 2）化學滅活方法 早在 20世紀初，就開始用甲醛減毒制備破傷風類毒素，之后有用甲醛或苯酚滅活制成犬瘟熱疫苗。 20世紀 30年代，用結(jié)晶紫成功地研制出豬瘟疫苗。 1957年，采用 ?－丙烯內(nèi)脂研制成功了口蹄疫滅活疫苗等。 佐劑配制 ? 、佐劑作用 ? 對抗原的作用 佐劑吸附抗原后增加抗原的表面積，并改變活性基因的構(gòu)型，因而增強抗原的免疫原性；佐劑和抗原被巨噬細胞吞噬，對抗原加工處理，賦予較強的免疫原性，增強 T細胞和 B細胞的協(xié)同作用；延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，是抗原緩慢降解和緩慢釋放。 、佐劑作用 ? 對機體的作用 引起巨噬細胞、淋巴細胞及漿細胞等細胞浸潤，促進其繁殖，增強其活性；加速淋巴細胞的轉(zhuǎn)化成效應細胞；增加細胞膜的活性和胞漿變化，分泌輔助性因子；改變細胞功能，巨噬細胞表現(xiàn)為數(shù)量增多、膜表面積增大、產(chǎn)生大量輔助因子和前列腺素等調(diào)節(jié)因子， T細胞和 B細胞表現(xiàn)為數(shù)目增多、進入細胞增殖周期，膜表面成分發(fā)生改變，產(chǎn)生大量輔助因子（ LK）， B細胞則分化為漿細胞，分泌大量的抗體。 、佐劑標準 ? 無致癌或輔助致癌作用，不能誘導或促進腫瘤形成； ? 無毒性，純度高，注射、口服等對動物安全，無任何毒、副作用； ? 符合相關(guān)的質(zhì)量標準； ? 具有一定的吸附力； ? 能在動物體內(nèi)降解吸收，不易在組織中長期存留而誘發(fā)組織損傷； ? 不誘發(fā)自身超敏反應及與血清抗體結(jié)合形成有害的免疫復合物； ? 不含有與動物發(fā)生交叉反應的抗原物質(zhì)； ? 性能穩(wěn)定，佐劑抗原混合物儲存后不分解、不變質(zhì)、不產(chǎn)生有害物質(zhì)。 、佐劑的類型 ? 1）不溶性鋁鹽佐劑 包括氫氧化鋁膠、各種明礬和磷酸鋁等，與抗原混合后成為凝膠狀態(tài)，注射動物后可較長期存留在機體內(nèi)，持續(xù)釋放抗原，顯著提高抗體滴度。 這類佐劑在獸用生物制品中廣泛采用， 《 規(guī)程 》 現(xiàn)有的滅活疫苗中大多數(shù)用氫氧化鋁膠作為佐劑，如牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗等。鋁膠的質(zhì)量對產(chǎn)品的質(zhì)量有直接影響，因此 《 規(guī)程 》 中明確規(guī)定了氫氧化鋁膠質(zhì)量標準。 2）油佐劑 ? 早期有弗氏佐劑，以羊毛脂為乳化劑，具有親油親水性，乳化作用較好，但制出的乳劑非常粘稠。國外所用的油佐劑中廣泛采用的是礦物油和縮水甘露醇單油酸酯（ Arlacel A）。國內(nèi)廣泛選用注射白油、司本 80和吐溫80作為油佐劑。 ? 《 規(guī)程 》 中明確規(guī)定了注射白油（輕質(zhì)礦物油）的質(zhì)量標準，要求其性狀（相對密度、粘度）、酸度、重金屬、鉛、砷、稠環(huán)芳烴、固形石蠟及易碳化物等項檢驗均應符合規(guī)定。 ? 乳化劑不同、礦物油不同、乳化劑配合比例不同及乳化方法不同，均影響著乳劑的性狀和穩(wěn)定性。目前常用的劑型為油包水和水包油包水型。 、佐劑的類型 ? 3）蜂膠佐劑 蜂膠是蜜蜂采集植物分泌的樹脂，混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉和其他一些有機與無機物的一種天然物質(zhì)，具有廣譜的生物活性。蜂膠作為疫苗佐劑需進行純化，蜂膠佐劑具有良好的免疫增強作用，能增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的產(chǎn)生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。 、佐劑的類型 ? 4）人工合成佐劑 研究最多的屬胞壁酰二肽（ MDP）及其衍生物、海藻糖合成衍生物，已合成了多種 MDP的類似物和衍生物，這類佐劑和抗原形成油包水乳劑，接種動物具有有效的佐劑活性，但作為水溶液接種動物后，迅速排出，其佐劑活性受到限制。海藻糖合成衍生物有海藻糖 6，6′ 雙霉菌酸酯（ TDM），又稱索狀因子，最初從分枝桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)。 TDM有多種生物學活性，抗感染和抗腫瘤。 、佐劑的類型 ? 5）微生物及其代謝產(chǎn)物佐劑 為細菌的菌體成分，具有明顯的佐劑作用。如革蘭氏陰性菌外膜脂多糖（ LPS）、分枝菌的胞壁成分、革蘭氏陽性菌的脂磷壁酸（ LTA）、蛋白毒素等。 ? 6）免疫刺激復合物佐劑（ ISCOM） 是由兩歧性抗原與Quil A和膽固醇 1： 1： 1的分子混勻共價結(jié)合而成的一種較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。 Quil A是從皂樹皮提取的一種糖苷，純化的 Quil A能與病毒被膜蛋白或細菌和寄生蟲的外膜蛋白的疏水基結(jié)合。 ISCOM現(xiàn)已廣泛用于多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫苗。 、佐劑的類型 ? 7）細胞因子類佐劑 多種細胞因子是有效的免疫增強劑，能增強由病毒、細菌和寄生蟲疫苗產(chǎn)生的保護作用。這類細胞因子主要有白細胞介素 白細胞介素 ?干擾素及白細胞介素 12。 ? 8）其它佐劑 這類佐劑主要有非離子阻斷共聚物表面活性劑、核酸及其類似物佐劑和左旋咪唑等。 制苗工藝 1）用鋁膠作佐劑 配苗時，將滅活的菌液和氫氧化鋁膠以一定的比例（ 3： 1— 9： 1）混合，再加入適量的硫柳汞和苯酚充分振蕩而成。用明礬作佐劑配苗時，按滅活的菌液量加入明礬溶液 1－ 2％，充分振蕩，然后沉淀而成。 ? 2）用油佐劑配苗，以白油、司本和硬脂酸鋁為油相，以含 2— 4%吐溫的抗原液為水相，按水相與油相 1： 1— 1： 4（ V/V）的比例配制。在膠體磨或乳劑缸內(nèi)配制成油包水或水包油包水疫苗。 ? 3）蜂膠作佐劑 配苗時，在滅活的抗原液（病毒液或菌液）中加入蜂膠乙醇浸液，使每 ml抗原液中含蜂膠 10mg，變加變振蕩，成為乳濁狀，即為蜂膠佐劑疫苗。 （二）活疫苗制備技術(shù) ? 弱毒活疫苗是用人工培育的弱菌（毒）株或自然弱（無）毒菌（毒）株或異種菌（毒）株或基因工程弱毒疫苗株生產(chǎn)的，對原宿主動物無致病性或引起亞臨床感染，但能使接種動物產(chǎn)生免疫力，以抵抗由該種病原引起的疾病。弱毒疫苗又稱活疫苗，大多數(shù)采用冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)成凍干疫苗，少數(shù)為液體（濕）疫苗。弱毒疫苗具有用量少、成本低、免疫力產(chǎn)生快、免疫期長等優(yōu)點。 菌（毒）種的選育 ? 、 菌種的選育 ? 1） 自然弱毒菌株 自然界中存在著具有免疫原性的自然弱毒株，可以用于生產(chǎn)活疫苗。如布魯氏菌病豬 2號株就是自然界中存在的弱毒株，已成功地用于制作活疫苗。 ? 2） 人工傳代致弱菌株 在培養(yǎng)基中或非宿主體內(nèi)等連續(xù)傳代減弱病原的致病性，以制作活疫苗。如致弱的兔、山羊、綿羊牛傳染性胸膜肺炎菌株、布魯氏菌羊型 5號菌株、乳兔肺致弱的豬支原體肺炎疫苗株等。 、 菌種的選育 ? 3） 改變培養(yǎng)環(huán)境致弱菌株 在體外培養(yǎng)傳代病原菌時，某些突變株在正常環(huán)境中不易生長發(fā)育而死亡，但改變培養(yǎng)溫度（提高或降低），或在培養(yǎng)基中加入有抑制病原的化學物質(zhì)，有利于某些突變株的發(fā)育，如在培養(yǎng)基中加醋酸鉈分離培育出了抗醋酸鉈的豬副傷寒沙門氏菌和馬流產(chǎn)沙門氏菌弱毒菌株。 ? 4） 誘變菌株 射線處理病原微生物或在體外的培養(yǎng)基中加入化學誘變劑，都能提高微生物的突變率，從而有助于弱毒株的培育。如用黃色素培養(yǎng)基培育豬丹毒弱毒菌株。許多疫苗的溫度敏感株（ ts）都經(jīng)過誘變選擇的。 、毒種的選育 1） 自然弱毒株 選用自然界中具有免疫原性的天