化學(xué)檢測(cè)ppt課件(2)-閱讀頁
2025-05-21 12:13本頁面
【正文】 染料的最大吸收峰由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。 ? 在 595nm下測(cè)定的吸光度值 A595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry法要大的多。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要 5分鐘左右。因而完全不用像 Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。如干擾 Lowry法的 K+、 Na+、 Mg2+離子、 Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、 EDTA等均不干擾此測(cè)定法。 ? 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X100、十二烷基硫酸鈉（ SDS）和 NaOH。 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用 Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。氨與茚三酮和還原性茚三酮反應(yīng)，生成紫色化合物。 58 ? 實(shí)驗(yàn)操作 ? 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別取 0、 、 、 、 、 的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液于試管中，用水補(bǔ)足至 1ml。放置 5min后，加入 3ml60％乙醇稀釋，用分光度計(jì)測(cè)定 OD570。 59 ? 樣品氨基酸的測(cè)定 ? 取樣品液 1ml，加入 沖液；再加入 1ml茚三酮顯色液，充分混合后，蓋住試管口，在 100℃ 水浴中加熱 15min，自來水冷卻。（生成 的顏色在 60min內(nèi)穩(wěn)定） ? 將樣品 OD570測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可確定樣品中氨基酸含量。 測(cè)量氨基酸含量還有甲醛滴定法等等，因時(shí)間關(guān)系，在此不作具體介紹。 63 （ DNS法） ? 原理 蛋白質(zhì)的 ɑ氨基與熒光試劑丹磺酰氯在堿性條件下反應(yīng)，生成丹磺酰 蛋白質(zhì)（ DNS蛋白質(zhì)）。 此法靈敏度高，比茚三酮法高 10倍以上，比二硝基氟苯法高 100倍以上，可使用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成的測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束后，用真空干燥除去丙酮。開管后，蒸去鹽酸。或者用 ，將抽提液干燥除去乙酸乙酯，用少量丙酮溶解后進(jìn)行聚酰胺薄膜層析。 66 Edman法，即異硫氰酸苯脂分析法，也稱 PTC法。 67 ? 原理 蛋白質(zhì)（多肽）的游離 ɑ氨基與異硫氰酸苯脂反應(yīng)形成苯氨基硫甲酰 蛋白質(zhì)（ PTC蛋白質(zhì)）。 噻唑啉酮衍生物水解生成苯氨基硫甲酰 氨基酸（ PTC氨基酸），然后再環(huán)化生成乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸（ PTH氨基酸），經(jīng)過聚酰胺薄膜層析，再與標(biāo)準(zhǔn) PTH氨基酸層析圖譜比較，就可確定蛋白質(zhì)（多肽）的 N末端氨基酸。 PTC衍生物的環(huán)化 PTC蛋白質(zhì)中加入 ，蓋嚴(yán)于40℃ 保溫 30min，生成 PTC氨基酸后，再真空干燥除去三氟醋酸。 69 PTH氨基酸的抽提 在上述的 PTH氨基酸和殘肽混合液中加入 機(jī)溶劑（苯、乙酸乙酯等）抽提，振蕩分層后，吸取有機(jī)相。水相含殘肽，干燥后可繼續(xù)測(cè)下一個(gè)N末端氨基酸。 70 3. 2， 4－ 二硝基氟苯測(cè)定法 ? 原理 FDNB能在溫和條件下（室溫、 pH89)與蛋白質(zhì)的自由ɑ氨基定量地發(fā)生反應(yīng)，生成 DNP－蛋白質(zhì)。用有機(jī)溶劑抽提，除了堿性氨基酸的 DNP衍生物留在水溶液中，其他 DNP－氨基酸都在有機(jī)相中。 71 ? 蛋白質(zhì)的二硝基苯化 稱取一定量的蛋白質(zhì)（ 12umol），加入等量的碳酸氫鈉，溶于 5ml水中，再加入 2倍體積的 5％ FDNB乙醇溶液，混勻，蓋緊，于室溫下避光振搖 2h。沉淀用 1： 1乙醇 乙醚相繼洗滌。 72 DNP－蛋白質(zhì)水解 DNP－蛋白質(zhì)放入水解管，加入 沸點(diǎn)鹽酸，抽氣封管，于 105℃ 烘箱中水解 424h。醚層提取液蒸干乙醚后，得醚溶性 DNP－氨基酸（中性與酸性氨基酸）。 73 DNP－氨基酸檢測(cè) 將 DNP－氨基酸加少許丙酮溶解，點(diǎn)樣進(jìn)行聚酰胺薄膜雙向?qū)游觯孟铝腥軇┫到y(tǒng)展開： ⑴苯：冰醋酸＝ 80： 20（ V/V） ⑵ 88％甲酸：水＝ 50： 50 （ V/V） 將層析圖譜與標(biāo)準(zhǔn) DNP－氨基酸層析圖譜比較，可確定蛋白質(zhì)的 N末端氨基酸。 74 四 .蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè) (單獨(dú)講解） ? 蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測(cè)是指利用抗原與抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量分析的技術(shù)。 75 五 .核酸的化學(xué)檢測(cè) ? 根據(jù)核酸中所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)測(cè)定核酸的含量，主要方法有 定磷法、二苯胺法和地衣酚法。無機(jī)磷在酸性條件下與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸。鉬藍(lán)在 650660nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，通過測(cè)定 OD650，測(cè)定磷的含量，進(jìn)一步可算出核酸含量。冷卻至室溫，于 650nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度OD650 。 78 核酸的消化 取 1ml1％的核酸溶液，加入 23ml5mol/L硫酸，于凱氏燒瓶中， 140160℃ 下消化 24h。取出冷卻后加 1ml蒸餾水，在沸水浴中加熱 10min，以分解消化過程中形成的焦磷酸。 79 ? 總磷和無機(jī)磷的測(cè)定 取樣品液 1ml加蒸餾水 2ml和定磷試劑 3ml，混勻，于 45℃ 恒溫水浴中反應(yīng) 25min。用 1ml蒸餾水代替樣品液作空白對(duì)照。取1ml按上述方法測(cè) OD650。 80 ? 核酸的計(jì)算 RNA量＝（總磷 無機(jī)磷） * DNA量＝（總磷 無機(jī)磷） * 注意定磷劑的配制： 3mol/L硫酸：水 :%鉬酸銨： 10％ Vit C=1： 2： 1:1，當(dāng)天混合使用。在 595nm處有最大吸收峰。少量的乙醛可提高反應(yīng)靈敏度，在使用前加入到配制好的二苯胺試劑中。分別吸取 0、 、 、 、 DNA標(biāo)準(zhǔn)液，補(bǔ)足蒸餾水至 2ml。冷卻后，分別測(cè)定 OD595。 83 樣品種 DNA含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，用 液配成一定濃度。 注意： 脫氧木糖和阿拉伯糖也有此反應(yīng)，可能會(huì)造成干擾。 85 ? 實(shí)驗(yàn)操作 地衣酚試劑的配制 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 稱取標(biāo)準(zhǔn) RNA，用蒸餾水配制成 100ug/ml的 RNA標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取 0、 、 、 、 ，分別添加蒸餾水至 ?；靹蚝?，于沸水浴中加熱 30min，冷卻后測(cè)定 OD670。 86 ? 樣品 RNA的測(cè)定 取 ，按上述方法測(cè) OD670 。 注意 。
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