化學(xué)檢測(cè)ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-06-02 12:13 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 6= ， 100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 ( g % ) = 每克樣品含氮克數(shù) 100 1/16% 蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)： 36 第二節(jié) 蛋白質(zhì)與氨基酸的化學(xué)檢測(cè) 含氮量 每 gN相當(dāng) P 肉、蛋、豆 16％ 面粉 ％ 奶品 ％ 花生 ％ 鮭精蛋白 ％ 37 ? 原理 將樣品與濃硫酸共熱時(shí)蛋白質(zhì)分解，其中氮與硫酸反應(yīng)生成硫酸胺，然后堿化蒸餾使氨游離。氨由硼酸吸收生成硼酸銨以標(biāo)準(zhǔn)酸滴定。從而可以計(jì)算出含氮量。 滴定時(shí)以甲基紅 溴甲酚綠混合液為指示劑，滴至溶液變?yōu)樽霞t色即為終點(diǎn)。 也可用標(biāo)準(zhǔn)酸吸收氨，再用標(biāo)準(zhǔn)堿滴定剩余酸。（甲基橙為指示劑，黃色為終點(diǎn)） 38 常量凱氏定氮裝置 39 微量凱氏定氮裝置簡(jiǎn)圖 40 微量凱氏定氮裝置 41 ? 實(shí)驗(yàn)操作 樣品處理 固體樣品應(yīng)在 105℃ 干燥至恒重。液體樣品可直接吸取一定量或者稀釋后吸取一定量進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)該使樣品的含氮量在 － 。 42 ? 消化 取一定量樣品，于 50ml干燥的凱氏燒瓶?jī)?nèi)。加入300mg硫酸鉀－硫酸銅混合粉末，再加入 3ml濃硫酸。電爐加熱，在通風(fēng)櫥中消化，瓶口加一小漏斗，先以文火加熱避免泡沫飛濺，不能讓泡沫上升到瓶頸，待泡沫停止發(fā)生后，加強(qiáng)火保持瓶?jī)?nèi)液體沸騰。時(shí)常轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶使樣品全部消化完全，直到消化液清澈透明。 另取凱氏燒瓶一個(gè)，不加樣品，其他操作相同，作空白對(duì)照。 43 ? 蒸餾 ? 將微量凱氏蒸餾裝置洗滌干凈。將凱氏燒瓶?jī)?nèi)的消化液冷卻后，全部轉(zhuǎn)入 100ml容量瓶中。凱氏燒瓶用蒸餾水洗滌三次，洗滌液全部轉(zhuǎn)入容量瓶?jī)?nèi)，再用蒸餾水定容。 ? 吸取 20ml稀釋消化液，置于蒸餾裝置反應(yīng)室中，加 10ml30％氫氧化鈉溶液，將玻璃塞塞緊，漏斗中加少許蒸餾水作為水封。 ? 取一三角瓶，加入 10ml硼酸－田氏指示劑混合液，置于冷凝管下口，冷凝管口浸沒(méi)在硼酸液面之下，保證氨的吸收。 ? 加熱水蒸氣發(fā)生器，沸騰后。夾緊夾子，開(kāi)始蒸餾。三角瓶中硼酸－指示劑混合液吸收蒸出來(lái)的氨，由紫紅色變?yōu)榫G色。蒸餾 15min，讓硼酸液面離開(kāi)冷凝管口，再蒸 1－ 2min沖洗冷凝管口。空白試驗(yàn)按相同操作進(jìn)行。 44 ? 滴定 ? 樣品和空白均蒸餾完畢后，用 定，至硼酸－指示劑混合液由綠色變回紫紅色，即為滴定終點(diǎn)。 45 ? 計(jì)算 樣品總氮含量（ mg）＝（ AB） *C*14*100/20 式中， A—— 樣品滴定時(shí)消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積， ml B—— 空白滴定時(shí)消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積， ml C—— 標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的當(dāng)量濃度 14—— 氮的相對(duì)分子質(zhì)量 20—— 用于蒸餾的稀釋消化液體積， ml 100—— 稀釋消耗液體積， ml 樣品粗蛋白含量（ mg）＝樣品總氮含量 * 46 (Biuret法 ) ? 原理 蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，具有雙縮脲反應(yīng)，即蛋白質(zhì)在堿性溶液中與二價(jià)銅離子結(jié)合，生成紫紅色絡(luò)合物。絡(luò)合物的顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和氨基酸組成無(wú)關(guān)。 47 ? 實(shí)驗(yàn)操作 雙縮脲試劑的配制 配置的溶液若出現(xiàn)黑點(diǎn)或紅色沉淀時(shí)，則不能再用。加入 ％碘化鉀可防止銅的析出。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 于試管中分別加入 0、 、 、 、 、％酪蛋白溶液，用水補(bǔ)足至 1ml。然后加入 4ml雙縮脲試劑，充分搖勻在室溫下反應(yīng) 30min，于 540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收率。以酪蛋白含量為橫坐標(biāo)，光吸收率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 48 ? 樣品測(cè)定 取樣品溶液 1ml，加入 4ml雙縮脲試劑，搖勻后在室溫下反應(yīng) 30min測(cè)定 540nm處光吸收率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查處蛋白質(zhì)含量。 3. 注意： 1～ 10mg蛋白質(zhì)。 ，所以測(cè)定前必須先使蛋白質(zhì)完全沉淀，去除其他干擾物質(zhì)。 ，快速，但測(cè)定不是十分精確。硫酸銨不干擾反應(yīng)，但 Tris緩沖液等給予陽(yáng)性反應(yīng)，干擾蛋白質(zhì)測(cè)定。 49 酚試劑法 (lowry法 ) ? 原理 福林 酚試劑由兩種試劑組成，其中的堿性銅試劑能與蛋白質(zhì)中的肽鍵發(fā)生雙縮脲反應(yīng)生成蛋白質(zhì) 銅復(fù)合物。另一種稀釋的苯酚試劑則與酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸殘基反應(yīng)，呈現(xiàn)藍(lán)色。兩種顯色反應(yīng)可以疊加，所以此法具有很高的敏感性。 50 ? 實(shí)驗(yàn)操作 福林 酚試劑的配制 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取一定量的結(jié)晶牛血清蛋白，溶于 ％的NaCl溶液中，配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液。（也可用酪蛋白，但需要經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量） 51 ? 樣品的測(cè)定 取 1ml樣品液（含蛋白質(zhì) 15～ 500ug），加入 5ml試劑甲，混勻于室溫放置 10min，再加入試劑乙 ，立即混勻，于室溫反應(yīng) 30min。然后選擇 500～ 750nm間一個(gè)波長(zhǎng)，以蒸餾水作空白對(duì)照測(cè)定吸光率。 蛋白質(zhì)含量高時(shí)，選擇靠近 500nm波長(zhǎng)測(cè)定；含量低時(shí)，選擇靠近 750nm波長(zhǎng)測(cè)定。 52 紫外吸收法 ? 由于蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在 280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用作定量測(cè)定。 ? 紫外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測(cè)定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)， ? 利用 280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來(lái)判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況是最常用的方法。 53 ? 紫外吸收法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差 。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。 ? 若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核
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