【正文】 注意 。混勻后，于沸水浴中加熱 30min，冷卻后測定 OD670。 注意： 脫氧木糖和阿拉伯糖也有此反應，可能會造成干擾。冷卻后，分別測定 OD595。少量的乙醛可提高反應靈敏度，在使用前加入到配制好的二苯胺試劑中。 80 ? 核酸的計算 RNA量＝（總磷 無機磷） * DNA量＝（總磷 無機磷） * 注意定磷劑的配制： 3mol/L硫酸：水 :%鉬酸銨： 10％ Vit C=1： 2： 1:1，當天混合使用。用 1ml蒸餾水代替樣品液作空白對照。取出冷卻后加 1ml蒸餾水，在沸水浴中加熱 10min，以分解消化過程中形成的焦磷酸。冷卻至室溫，于 650nm波長處測光密度OD650 。無機磷在酸性條件下與鉬酸銨反應生成磷鉬酸。 74 四 .蛋白質(zhì)的免疫檢測 (單獨講解） ? 蛋白質(zhì)的免疫化學檢測是指利用抗原與抗體之間的特異結(jié)合反應而對蛋白質(zhì)進行定性定量分析的技術。醚層提取液蒸干乙醚后，得醚溶性 DNP－氨基酸（中性與酸性氨基酸）。沉淀用 1： 1乙醇 乙醚相繼洗滌。用有機溶劑抽提，除了堿性氨基酸的 DNP衍生物留在水溶液中，其他 DNP－氨基酸都在有機相中。水相含殘肽，干燥后可繼續(xù)測下一個N末端氨基酸。 PTC衍生物的環(huán)化 PTC蛋白質(zhì)中加入 ，蓋嚴于40℃ 保溫 30min，生成 PTC氨基酸后，再真空干燥除去三氟醋酸。 67 ? 原理 蛋白質(zhì)（多肽）的游離 ɑ氨基與異硫氰酸苯脂反應形成苯氨基硫甲酰 蛋白質(zhì)（ PTC蛋白質(zhì)）?；蛘哂?，將抽提液干燥除去乙酸乙酯，用少量丙酮溶解后進行聚酰胺薄膜層析。反應結(jié)束后，用真空干燥除去丙酮。 63 （ DNS法） ? 原理 蛋白質(zhì)的 ɑ氨基與熒光試劑丹磺酰氯在堿性條件下反應，生成丹磺酰 蛋白質(zhì)（ DNS蛋白質(zhì)）。（生成 的顏色在 60min內(nèi)穩(wěn)定） ? 將樣品 OD570測定與標準曲線對照，即可確定樣品中氨基酸含量。放置 5min后，加入 3ml60％乙醇稀釋，用分光度計測定 OD570。氨與茚三酮和還原性茚三酮反應，生成紫色化合物。 ? 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X100、十二烷基硫酸鈉（ SDS）和 NaOH。因而完全不用像 Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)－染料復合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry法要大的多。 ? 考馬斯亮蘭 G250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色。 ? 因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。 53 ? 紫外吸收法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差 。 52 紫外吸收法 ? 由于蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。 50 ? 實驗操作 福林 酚試劑的配制 蛋白質(zhì)標準溶液配制 準確稱取一定量的結(jié)晶牛血清蛋白，溶于 ％的NaCl溶液中，配制成適當濃度的標準液。硫酸銨不干擾反應，但 Tris緩沖液等給予陽性反應，干擾蛋白質(zhì)測定。 48 ? 樣品測定 取樣品溶液 1ml，加入 4ml雙縮脲試劑，搖勻后在室溫下反應 30min測定 540nm處光吸收率，根據(jù)標準曲線查處蛋白質(zhì)含量。加入 ％碘化鉀可防止銅的析出。 44 ? 滴定 ? 樣品和空白均蒸餾完畢后，用 定，至硼酸－指示劑混合液由綠色變回紫紅色，即為滴定終點。夾緊夾子，開始蒸餾。凱氏燒瓶用蒸餾水洗滌三次，洗滌液全部轉(zhuǎn)入容量瓶內(nèi)，再用蒸餾水定容。時常轉(zhuǎn)動燒瓶使樣品全部消化完全，直到消化液清澈透明。液體樣品可直接吸取一定量或者稀釋后吸取一定量進行測定，應該使樣品的含氮量在 － 。從而可以計算出含氮量。 蔗糖水解： 于 250m1錐形瓶中加入 5 ml 6 mol/L鹽酸，臵 68— 70℃水浴 中 15 min ,速冷。 蔗糖的測定 31 第一節(jié) 糖類的化學檢測 淀粉的測定方法有多種，部分是根據(jù)淀粉的理化性質(zhì)而建立的。 30 第一節(jié) 糖類的化學檢測 蔗糖是葡萄糖和果糖組成的雙糖，沒有還原性，不能用堿性銅鹽試劑直接測定，但在一定條件下，蔗糖可水解為具有還原性的葡萄糖和果糖（轉(zhuǎn)化糖）。 29 注意事項： OD值最好在 － 。 在分光光度計上，測 520nm波長處溶液的 OD值。 26 ? DNS法原理 3,5 二硝基水楊酸在中性或偏堿性條件下與多糖水解的還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物 — 3氨基 5 硝基水楊酸 , 在一定范圍內(nèi) , 還原糖的量和反應液的顏色呈正比。 24 上述 4種糖檢測方法都是通過滴定的方法進行糖含量的測量；此外，我們還可以通過比色法等檢測糖的含量，主要有苯酚 硫酸法、蒽酮 硫酸法和 DNS法等，其原理分別如下： 25 ? 硫酸法原理 苯酚硫酸法主要用于多糖檢測。 以葡萄糖含量為縱坐標，以空白滴定值減去標準樣品滴定值得出的硫代硫酸鈉毫升數(shù)為橫坐標，繪標準曲線。臵于沸水浴中加熱 10min，冷卻至室溫。 （ 2）標準碘液配制， （ 3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸鈉滴定試劑中全部碘 醛糖 + I2 +3 NaOH = 醛糖酸鈉 + 2 NaI +2H2O I2 + 2 NaOH = NaIO + NaI + H2O NaIO + NaI + 2 HCl = I2 + 2 NaCl + H2O 20 第一節(jié) 糖類的化學檢測 碘量瓶中， ＋ mol/LNaOH＋ 5mL空白液，搖勻后暗反應 15min＋ 1mL1mol/L硫酸溶液，用，加 ％淀粉液作指示劑，滴定至藍色消失，記錄 V0 (4)樣品滴定：以 5mL樣品液代替空白液， V1 (5) 計算： 醛糖含量＝ （ V0 － V1） C M n 注意：暗反應后需酸化再滴定，滴定時開始輕搖（碘揮發(fā)），后再搖（淀粉吸附碘） 配合次甲基藍法測定某些糖含量（如果糖） 21