化學(xué)檢測ppt課件(2)-資料下載頁
2025-05-06 12:13本頁面
【正文】 化生成 PTH氨基酸。 69 PTH氨基酸的抽提 在上述的 PTH氨基酸和殘肽混合液中加入 機(jī)溶劑（苯、乙酸乙酯等）抽提，振蕩分層后，吸取有機(jī)相。再重復(fù)抽提二次，合并有機(jī)相，真空干燥得到 PTH氨基酸。水相含殘肽，干燥后可繼續(xù)測下一個N末端氨基酸。 PTH氨基酸的檢測 直接用聚酰胺薄膜層析檢出 PTH氨基酸，或者將其水解成游離氨基酸用紙層析或氨基酸自動分析儀檢測。 70 3. 2， 4－ 二硝基氟苯測定法 ? 原理 FDNB能在溫和條件下（室溫、 pH89)與蛋白質(zhì)的自由ɑ氨基定量地發(fā)生反應(yīng)，生成 DNP－蛋白質(zhì)。 DNP－蛋白質(zhì)經(jīng)酸水解，生成 DNP－氨基酸和氨基酸混合液。用有機(jī)溶劑抽提，除了堿性氨基酸的 DNP衍生物留在水溶液中，其他 DNP－氨基酸都在有機(jī)相中。 DNP－氨基酸呈現(xiàn)黃色，可用聚酰胺薄膜層析或其他層析，電泳分離后再進(jìn)行定性定量測定。 71 ? 蛋白質(zhì)的二硝基苯化 稱取一定量的蛋白質(zhì)（ 12umol），加入等量的碳酸氫鈉，溶于 5ml水中，再加入 2倍體積的 5％ FDNB乙醇溶液，混勻，蓋緊，于室溫下避光振搖 2h。反應(yīng)結(jié)束后，用一定量的鹽酸酸化，離心收集沉淀。沉淀用 1： 1乙醇 乙醚相繼洗滌。所得 DNP－蛋白質(zhì)置于干燥器中避光干燥。 72 DNP－蛋白質(zhì)水解 DNP－蛋白質(zhì)放入水解管，加入 沸點(diǎn)鹽酸，抽氣封管，于 105℃ 烘箱中水解 424h。 DNP－氨基酸抽提 水解完畢啟封后，用 23倍體積的蒸餾水稀釋，再用乙醚提取三次，合并醚層，以去除殘酸。醚層提取液蒸干乙醚后，得醚溶性 DNP－氨基酸（中性與酸性氨基酸）。水層蒸干后，反復(fù)用水溶解和蒸干，得到堿性氨基酸的 DNP－衍生物。 73 DNP－氨基酸檢測 將 DNP－氨基酸加少許丙酮溶解，點(diǎn)樣進(jìn)行聚酰胺薄膜雙向?qū)游?，用下列溶劑系統(tǒng)展開： ⑴苯：冰醋酸＝ 80： 20（ V/V） ⑵ 88％甲酸：水＝ 50： 50 （ V/V） 將層析圖譜與標(biāo)準(zhǔn) DNP－氨基酸層析圖譜比較，可確定蛋白質(zhì)的 N末端氨基酸。 將圖譜中的黃色斑點(diǎn)剪下，用 1％碳酸氫鈉洗脫后，在 360nm的波長下測定光密度可進(jìn)行定量測定。 74 四 .蛋白質(zhì)的免疫檢測 (單獨(dú)講解） ? 蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測是指利用抗原與抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)而對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量分析的技術(shù)。 ? 免疫反應(yīng)具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，非常使用于蛋白質(zhì)的檢測。 75 五 .核酸的化學(xué)檢測 ? 根據(jù)核酸中所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)測定核酸的含量，主要方法有 定磷法、二苯胺法和地衣酚法。 76 ? 原理 核酸中含的磷，用強(qiáng)酸消化，變成無機(jī)磷。無機(jī)磷在酸性條件下與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸。在還原劑作用下，磷鉬酸生成藍(lán)色的化合物－鉬藍(lán)。鉬藍(lán)在 650660nm波長處有最大吸收峰，通過測定 OD650，測定磷的含量，進(jìn)一步可算出核酸含量。 77 ? 實(shí)驗操作 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)備不同含量的無機(jī)磷溶液各 1ml加蒸餾水 2ml和定磷試劑 3ml，混勻，于 45℃ 恒溫水浴中反應(yīng)25min。冷卻至室溫，于 650nm波長處測光密度OD650 。 以標(biāo)準(zhǔn)磷含量（ mg）作橫坐標(biāo)， OD650為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 78 核酸的消化 取 1ml1％的核酸溶液，加入 23ml5mol/L硫酸，于凱氏燒瓶中， 140160℃ 下消化 24h。待溶液呈黃褐色后，取出，稍冷，加入 12滴 30％雙氧水，繼續(xù)消化，直到溶液透明為止。取出冷卻后加 1ml蒸餾水，在沸水浴中加熱 10min，以分解消化過程中形成的焦磷酸。然后移到 100ml容量瓶中定容。 79 ? 總磷和無機(jī)磷的測定 取樣品液 1ml加蒸餾水 2ml和定磷試劑 3ml，混勻，于 45℃ 恒溫水浴中反應(yīng) 25min。冷卻至室溫，于 650nm波長處測光密度 OD650 。用 1ml蒸餾水代替樣品液作空白對照。 取 1ml1％核酸溶液，不經(jīng)消化，稀釋 100倍。取1ml按上述方法測 OD650。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出對應(yīng)的總磷和無機(jī)磷含量。 80 ? 核酸的計算 RNA量＝（總磷 無機(jī)磷） * DNA量＝（總磷 無機(jī)磷） * 注意定磷劑的配制： 3mol/L硫酸：水 :%鉬酸銨： 10％ Vit C=1： 2： 1:1，當(dāng)天混合使用。 81 ? 原理 ? DNA中的 2脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)。在 595nm處有最大吸收峰。在 40－ 400ug范圍內(nèi)， OD與 DNA濃度成正比。少量的乙醛可提高反應(yīng)靈敏度，在使用前加入到配制好的二苯胺試劑中。 82 ? 實(shí)驗操作 二苯胺試劑配制 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取一定量的標(biāo)準(zhǔn) DNA，用 配成 200ug/ml的 DNA標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取 0、 、 、 、 DNA標(biāo)準(zhǔn)液，補(bǔ)足蒸餾水至 2ml。然后各加入 3ml二苯胺試劑，混勻，于 60℃ 水浴中保溫1h。冷卻后，分別測定 OD595。以 DNA濃度為橫坐標(biāo)， OD595為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 83 樣品種 DNA含量測定 準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，用 液配成一定濃度。取 2ml樣品液按上述方法測定 OD595，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品液中的 DNA含量。 注意： 脫氧木糖和阿拉伯糖也有此反應(yīng)，可能會造成干擾。 84 RNA含量 ? 原理 ? 核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵存在下，與 3,5－二羥甲苯反應(yīng)生成綠色物質(zhì)，該綠色物質(zhì)在670nm處有光吸收高峰，在一定濃度范圍內(nèi)，吸光度和 RNA濃度成正比。 85 ? 實(shí)驗操作 地衣酚試劑的配制 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 稱取標(biāo)準(zhǔn) RNA，用蒸餾水配制成 100ug/ml的 RNA標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取 0、 、 、 、 ，分別添加蒸餾水至 。然后各自加入 ?；靹蚝?，于沸水浴中加熱 30min，冷卻后測定 OD670。以RNA含量為橫坐標(biāo)， OD670為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 86 ? 樣品 RNA的測定 取 ，按上述方法測 OD670 。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出 RNA含量。 注意 。 因為 所有戊糖均可進(jìn)行地衣酚反應(yīng)， 所以 DNA會干擾測量。
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