蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列測定-閱讀頁
2025-05-17 13:42本頁面
【正文】 白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、 N端封閉蛋白的分 析以及 DNA探針的設(shè)計(jì)。蛋白質(zhì)化學(xué) 工作者曾利用羧肽酶分析 C端氨基酸殘基，但是由于不同的羧肽酶對(duì)個(gè) 別氨基酸殘基有選擇性，使用時(shí)仍有一定困難。所以介紹一種自動(dòng)化 C端測序方法的原理及應(yīng)用。 一個(gè)完整的 C端序列分析包括以下幾個(gè)步驟： (1)活化 蛋白質(zhì)和多肽 C端的自由羧基與乙酸酐反應(yīng)生成混合酸酐，并進(jìn)一步 環(huán)化成嗯唑酮，而側(cè)鏈上的羧基形成的混合酸酐難以成環(huán)。 (2)酰胺化保護(hù)側(cè)鏈羧基 側(cè)鏈羧基形成混合酸酐后，與硫氰哌啶進(jìn)一步作用形成酰 胺，以保護(hù)側(cè)鏈。用溴甲基萘選擇性地烷基化修飾硫原子，形成 AlkylatedTH(ATH)衍生物，裂解產(chǎn)率將大大提高。在活 化過程中，乙酸酐也會(huì)與羥基反應(yīng)將其乙?；?，但反應(yīng)不完 全，在 N— 甲基咪唑 (NMl)和乙酸酐的共同作用下， Thr和 Ser上的羥基基本被乙?；?。 因此，整個(gè)測序過程只需在開始時(shí)對(duì) C端進(jìn)行一次性活 化，并修飾 Asp和 Glu側(cè)鏈羧基以及 The和 Ser的羥基。 二、 C端蛋白質(zhì)序列儀 近年來，已有商品化的 C端序列儀問世。 四、影響 C端測序反應(yīng)產(chǎn)率的因素 C端測序副反應(yīng)較多，最高初始產(chǎn)率僅為 20％，而對(duì)于 Glu， Asp， Ser， Thr等氨基酸，其產(chǎn)率將更低。另外，一旦遇到 Pro，由于吡咯環(huán)的存在而不能與乙酸酐 反應(yīng)成環(huán)，整個(gè)測序過程將終止。 此外，因?yàn)椴煌陌被岱磻?yīng)產(chǎn)率不同，所以，對(duì)圖譜的分析也比 N 端測序復(fù)雜，需要較多的經(jīng)驗(yàn)。 另外，由于副反應(yīng)的存在，有的氨基酸將生成不止一種 ATH衍生物。 五、結(jié)語和展望 目前， C端序列測序技術(shù)已初步成熟，并開始發(fā)揮作用。 因此，目前的主要問題是如何提高反應(yīng)的產(chǎn)率，特別是如何改善 T， S， D， E幾種氨基酸的測定，以及如何解決 P終止測序的問題。另外，近年來發(fā)現(xiàn)，很多活性多肽的 C端是酰胺化的，如果能檢測 酰胺化的 C端殘基，將對(duì)活性多肽的研究有很大的幫助。
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